使用微流体隔室化快速多路复用基于crispr的诊断相关申请的交叉引用1.本技术要求于2020年1月14日提交的美国临时申请no.62/961,122的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域：
：2.一种基于crispr的测定法，其用于使用微流体设备从临床或非临床样品中检测多达数千个感兴趣的核酸靶。
背景技术：
：：3.crispr/cas技术正在彻底改变功能基因组学领域，因为它允许精确的基因编辑。最近研究人员发现，cas蛋白在与靶结合后可以随意切割核酸，这被称为cas“旁切”活性(“collateral”activity)。具有旁切切割特性的cas蛋白可用于开发快速和灵敏的基于crispr的诊断测试，以检测来自病原体或其他核酸靶的核酸。例如，gootenbergetal.,2017,“nucleicaciddetectionwithcrispr-cas13a/c2c2,”science356:438-442，报道称cas13可以在正确识别靶后不加选择地切割单链(ss)rna。cas14在与其ssdna或dsdna靶结合后还显示出切割ssdna的旁切活性。参见harringtonetal.,2018,“programmeddnadestructionbyminiaturecrispr-cas14enzymes,”science362:839-842。两个研究小组独立发现了cas12a/cpf1的旁切ssdna切割活性(lietal.,2018,“crispr-cas12a-assistednucleicaciddetection,”celldiscov4,20；和chenetal.,2018,“crispr-cas12atargetbindingunleashesindiscriminatesingle-strandeddnaseactivity,”science2018:436-439)。4.已经开发了基于cas旁切活性的检测测定法，包括基于cas13的测定法(“sherlock”；参见，例如，gootenbergetal.,2018,“multiplexedandportablenucleicaciddetectionplatformwithcas13,cas12a,andcsm6”science360:439-444,以及基于cas12a的检测(“detectr”；seechenetal.,2018,同上)。还参见lietal.,2019,“crispr/cassystemstowardsnext-generationbiosensing”trendsinbiotechnology37:7:730-743；以及sashital,2018,“pathogendetectioninthecrispr-casera,”genomemed.10:32。所有引用的参考文献均以引用方式全文并入本文以用于所有目的。技术实现要素：5.本发明公开了一种感兴趣的核酸靶的检测方法，所述核酸靶例如来自病原微生物的核酸、变异基因序列和其他靶dna或rna。附图说明6.图1说明了本发明的一实施方案。图例1说明了从样品中提取核酸(例如，分离dna和/或rna)。在该图示中，进行测定法以确定样品中是否存在编码靶1(t1)、靶2(t2)、靶3(t3)和靶4(t4)中的一者或多者的核酸。该图将基因组dna(gdna)、循环胎儿dna(cfdna)和cdna确定为非限制性示例。图例2说明了各种靶的扩增。在该图示中，靶1和3被扩增，靶2和4未被扩增(例如，样品中不存在)，并且产生了其他靶和/或非靶扩增子。图例3通过将扩增的拷贝均等分成等分试样(例如液滴、微孔、分区)并引入靶特异性向导rna、cas蛋白和其他试剂以及报道分子来说明隔室化。图例4说明在含有对目标1特异的grna的隔室中，通过激活旁切活性而产生信号，这表明在样品中存在靶1。图例4说明在包含对靶2特异的grna的隔室中没有产生信号，这表明在样品中不存在靶2。可以顺序或同时检测来自多个隔室的信号。示例性信号是光信号和ph信号。具体实施方式1、概述7.为了说明而非限制，图1描述了本发明的一种方式，其包括以下步骤：8.步骤1：任选地从怀疑含有感兴趣的核酸靶的样品中提取核酸。9.步骤2：任选地扩增核酸，包括如果存在于样品中的感兴趣的靶。10.步骤3：使用微流体技术(微流体通道的分区、电润湿液滴、通道中的液滴封装等)将来自样品的核酸或来自步骤2的扩增产物(扩增子)(包括感兴趣的核酸靶的拷贝)分配到微隔室(例如，微孔、液滴或微流体室)。11.步骤4：将每个微隔室中的核酸底物(核酸和/或扩增子)暴露于反应条件(例如，与包括cas蛋白、指导核酸(grna)和报道系统(例如，报道寡核苷酸)在内的试剂组合)。如果核酸靶序列存在于隔室中，则cas-grna复合物将结合，导致在隔室中cas蛋白旁切活性的激活和报道系统的激活(例如，报道寡核苷酸的切割)。12.步骤5：隔室中的报道系统的激活(例如，报道寡核苷酸的切割)导致可检测信号的产生或变化。检测到该信号。2.详细分析13.本节提供额外的细节和非限制性示例。2.1步骤1：从怀疑含有一个或多个感兴趣的核酸靶的一份或多份样品中提取核酸。14.样品可以是任何含有核酸(例如，dna或rna)并怀疑含有一种或多种靶核酸序列的材料。合适的样品包括临床样品(例如血液、尿液、脑脊液等)、农业样品、环境样品、食品样品等。15.样品中的核酸可以是dna和/或rna，包括例如来自人类或非人类动物的核酸、来自植物或真菌的核酸、来自原核生物或原核生物群体的核酸、以及它们的混合物。所检测的靶核酸可以是基因组dna、线粒体dna、mrna、rrna或cdna。在一种方式中，核酸来自微生物或微生物群体(例如，微生物组，例如肠道微生物组)。在某些情况下，核酸来自病原体。在一种方式中，样品包含来自多种来源的核酸，例如来自多个患者的合并核酸、包含胎儿和母体核酸两者的母体样品、包含循环肿瘤dna的患者样品或包含来自真核生物(例如人类)和原核生物(例如微生物组细菌或致病细菌)的核酸的样品。16.可以在不纯化或富集核酸的情况下分析样品。替代地，可以在扩增之前纯化核酸(与样品的非核酸组分部分地或基本上分离)。用于核酸纯化的方法是本
技术领域：
：公知的。在另一种方式中，可以在扩增步骤之前富集靶核酸。例如，可以使用杂交捕获(或“杂交富集”)方法分离感兴趣的特定序列(靶核酸)或定义的序列类别(例如，外显子dna)。参见，例如gaudin,m.andchristelle,d.,2018,“hybridcapture-basednextgenerationsequencinganditsapplicationtohumaninfectiousdiseases,”frontiersinmicrobiology9:2924。17.在扩增之前、同时或之后，可以对来自样品的核酸进行操作、修饰或转化。例如，可以使用来自样品的rna来制备cdna。作为另一示例，衔接子可以掺入核酸(例如，cdna、rna或感兴趣的扩增子)中。在一种方式中，t1-t4可以是由来自病原细菌的核糖体rna制成的cdna，并且包括特异性识别病原体的序列。在一种方式中，t1-t4可以是编码由某些细菌携带的耐药性标记的dna序列。样品核酸或扩增子的浓度可以在隔室化或其他步骤之前(例如，通过稀释)调整。2.2步骤2：从样品中扩增核酸靶18.在一些方式中，可以在检测之前扩增核酸靶序列。替代地，可以在没有扩增的情况下进行测定。在这种方式中，通常在缓冲液中的样品或分离但未扩增的核酸可以分配到微隔室中。为方便起见，扩增和未扩增的靶核酸可称为“底物靶核酸”。19.许多核酸扩增方法是本领域已知的并且可以用于本发明。扩增通常在下文讨论的隔室化步骤之前进行。当进行扩增时，扩增可以是靶向扩增，也可以是非靶向扩增。“靶向扩增”是指一种或多种特异性靶序列的优先扩增。例如，可以使用被设计用于扩增具有存在的特异性序列的核酸的引物组合进行pcr或rt-pcr(逆转录pcr)。靶向扩增的方法包括使用定义的引物进行pcr、rt-pcr、rpa或rt-rpa(重组酶聚合酶扩增)或nasba(基于核酸序列的扩增)。例如，多个引物对可用于(例如，使用pcr)扩增来自样品的多个靶序列。参见，例如，美国专利no.7,666,598；deimanetal.,2002,."characteristicsandapplicationsofnucleicacidsequence-basedamplification(nasba)".mol.biotech.20:163–180。在一种方式中，多重扩增(例如多重pcr)在容器中进行，并且含有扩增子产物的扩增反应混合物被分配到隔室中。20.在一些实施方案中，扩增是非靶向扩增，例如全基因组扩增(wga)。在一些情况下，非靶向扩增在逆转录步骤之后进行。示例是dop-pcr、malbac、mda、nasba和lianti。参见，例如，teleniusetal.,1992,"degenerateoligonucleotide-primedpcr:generalamplificationoftargetdnabyasingledegenerateprimer,"genomics13,718–725；deanetal.,2002,"comprehensivehumangenomeamplificationusingmultipledisplacementamplification"pnas99:5261-5266；zongetal.,2012,"genome-widedetectionofsingle-nucleotideandcopy-numbervariationsofasinglehumancell,"science338:1622–1626和chenetal.,2017,"single-cellwhole-genomeanalysesbylinearamplificationviatransposoninsertion(lianti)"science356:189–194。21.扩增步骤可以在管(例如，eppendorf管或pcr条)中、在微流体芯片、液滴或任何其他合适的隔室化平台上进行。在微流体芯片的情况下，扩增步骤可以与隔室化步骤(步骤3)集成到单个芯片中。同样，在液滴平台中，可以在一个微流体液滴中进行扩增；然后将内容物(例如，用缓冲液)稀释并分成不同的液滴，每个液滴中具有相同数量和类型的模板。22.扩增可以产生rna扩增子或dna扩增子。不同的扩增可以与不同的检测方法相结合，部分取决于扩增子是dna还是rna。2.3步骤3：将扩增子或靶核酸分配到隔室中23.在扩增之后，扩增产物，包括感兴趣的核酸靶的拷贝，被分配或分成等分试样或微隔室。示例性的微隔室包括但不限于微孔、微室和微滴。用于这种隔室化的微流体设备和方法是本领域已知的，其包括但不限于：·自动移液到微孔中；·使用自填充微孔阵列(参见例如，kangetal.,2010,“cellconfinementinpatternednanoliterdropletsinamicrowellarraybywiping,”jbiomedmaterres93:547–557)·使用微流体通道分配到微室中(参见，例如，fluidigmcorp.的美国专利no.7,476,363和no.8,591,834)；·分散成液滴(参见，例如，bectondickinsonandco.的us20190331585a1)；·将具有不同crispr-cas/grna组合的液滴与包含单个靶扩增子的液滴组合；·电润湿液滴(参见，例如，advancedliquidlogicinc.的us8716015b2)；·通道中的液滴封装(参见，例如，芝加哥大学的us9477233b2)。应当理解，上述分隔或等分技术是为了说明，但本发明不限于特定的分隔方法。24.优选地，在每个隔室包含大约相同体积的扩增子溶液的意义上，将样品均分。理想的是各个隔室包含大约相同数量和类型的核酸底物，以便隔室之间的主要变量是存在的grna。每个隔室的体积范围可以从皮升到微升(例如，100皮升到500微升，例如100到1,000皮升、1到100纳升、100纳升到10微升、或10微升到500微升)。隔室的数量通常多于10个并且可以在10到106个的范围内，例如10到10,000、10到100、100到10,000或1,000到10,000)。2.4步骤4：底物核酸与试剂组合25.每个隔室中的底物(扩增子或未扩增的核酸)可以与试剂组合以进行测定。即，在微隔室中提供包含核酸(包括模板，如果存在)和测定试剂的测定。测定试剂包括(1)cas蛋白，(2)向导rna(grna)，(3)报道系统(例如报道寡核苷酸)，以及(4)缓冲液、辅因子和其他辅助试剂。26.用于将试剂与靶核酸组合的过程将根据微流体平台而变化。示例性平台和方法在上文第2.3节中进行了描述。例如，在基于微孔的平台中，试剂和底物核酸可以通过将单个试剂和试剂混合物自动移液到每个孔中来组合。27.可以以任何顺序或组合添加试剂，只要避免过早激活cas旁切活性即可。通常将多种不同的grna与等分的cas蛋白混合以允许组装cas-grna核糖核蛋白(rnp)复合物。在某些情况下，在添加报道系统部件之前，将cas和grna混合以组装rnp复合物。在这种情况下，可以将组装好的rnp添加到具有相同数量和类型的模板的各个样品隔室中。cas、grna、激活模板序列和报道系统都存在(例如，在隔室或等分试样中)的条件可以称为“完整测定”。28.如果隔室包含被该隔室中的cas蛋白/grna复合物识别的靶核酸序列，则cas-grna复合物将结合靶并且将激活cas蛋白旁切活性。通过在每个隔室中提供报道系统(例如，报道寡核苷酸)，可以检测到隔室中cas蛋白旁切活性的激活。在一种方式中，隔室中的报道寡核苷酸被切割并检测到切割，这表明包含靶序列的多核苷酸存在(或曾经存在)于隔室中。29.应当理解，在一些多路复用实施方案中，通过使用多个不同的grna来测定多个靶序列。通过改变grna中的互补序列(通常为17-25bp)，可以在不同的隔室中测定感兴趣的不同的核酸靶或不同的区域。在某些平台中，需要将每个隔室(例如，孔或液滴)与隔室中包含的grna相关联。在一种方式中，在隔室的gdna含量可基于隔室的位置来确定的意义上，grna是可寻址的。这样，从任何特定隔室检测到的信号可以对应于该隔室中的grna，从而允许用户将来自特定隔室的信号解释为该隔室包含对应于grna序列的靶序列的指示。在一种方式中，在已知(可寻址)位置(例如阵列中的微孔)的各个隔室中具有特异性grna，因此来自任何位置的信号变化都可以与grna含量相关联。可以根据空间信息(例如，通过拍摄阵列中微孔的荧光图像)记录信号变化。替代地，可以记录依次通过检测器的各个隔室(例如液滴)的信号。在液滴平台的情况下，使用适当设计的微流体电路和程序，可以产生含有预定的已知grna的液滴。在这种方式中，来自任何液滴的信号都可以与液滴的已知grna含量相关联。可以包括没有扩增模板或没有grna的阴性对照。2.4.2cas蛋白30.在某些实施方案中，扩增子是dna，并且cas蛋白具有识别dna的旁切活性(即，旁切活性是dnase活性)。在一些实施方案中，cas蛋白是cas12a或cas14或其他dna识别cas蛋白。dna扩增子和dna识别cas蛋白31.产生dna扩增子的扩增方法可用于具有dna切割旁切活性的cas蛋白(例如，cas12a或cas14)。产生dna扩增子的扩增方法的示例包括dop-pcr、malbac和mda。参见teleniusetal.,1992,"degenerateoligonucleotide-primedpcr:generalamplificationoftargetdnabyasingledegenerateprimer,"genomics13,718–725；deanetal.,2002,"comprehensivehumangenomeamplificationusingmultipledisplacementamplification"pnas99:5261-5266；zongetal.,2012,"genome-widedetectionofsingle-nucleotideandcopy-numbervariationsofasinglehumancell".science338:1622–1626。rna扩增子和rna识别cas蛋白32.产生rna扩增子的扩增方法可用于具有rna消化旁切活性的cas蛋白(例如，cas13)。扩增可以包括逆转录和/或转录步骤。一种合适的扩增方法是通过转座子插入的线性扩增(lianti)，它产生ssrna。参见chenetal.,2017,"single-cellwhole-genomeanalysesbylinearamplificationviatransposoninsertion(lianti)"science356:189–194。其他rna扩增方法包括nasba(基于核酸序列的扩增)和lamp(环介导的等温扩增)。一般cas蛋白33.任何合适的具有旁切活性的cas蛋白可以与合适的grna组合用于本文所述的测定的实践中。表1提供了casgrna复合物识别的靶的示例以及旁切核酸酶活性的示例性底物。使用标准测定，熟练的从业者能够识别具有旁切活性的cas蛋白。参见，例如，chenetal.,lietal.,gootenbergetal.,和harringtonetal.，均同上。诸如最佳温度、底物、ph等测定条件对于各种cas蛋白是已知的和/或由熟练的从业者容易地确定。在某些情况下，cas蛋白来自cas12家族(包括cas12a和天然存在的cas12蛋白的工程形式或变体)。在某些情况下，cas蛋白来自cas13家族(包括cas13a/c2c2和天然存在的cas13蛋白的工程形式或变体)。在某些情况下，cas蛋白来自cas14家族(包括天然存在的cas14蛋白的工程形式或变体)。表11.lietal.,2018,supra；chenetal.,2018,同上。2.gootenbergetal.,2018,同上。3.harringtonetal.,2018,同上。2.4.3向导rna(grna)和crispr多路复用34.为了使cas蛋白-grna复合物结合dna，可以使用包含与靶序列互补的序列的grna。通常，互补序列之后是靶链上的相邻原型间隔序列(protospacer)或“pam”序列。cas蛋白-grna复合物可以只包含crrna(其包含结合靶序列中的特异性序列的向导rna)或包含该crrna与tracrrna。替代地，该复合物可以包含cas和单个向导rna(sgrna)，其中crrna和tracrrna都融合在单个分子中。为方便起见，在本公开中，所有sgrna、crrna和crrna/tracrrna都可以称为“grna”。35.同样，为了使cas蛋白-grna复合物结合rna，可以使用包含与靶序列互补的序列的grna。36.用于grna设计的各种方法是本
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：已知的并且可以用于本发明。37.在本发明中可以通过在同一隔室中使用多路复用组的grna来实现多路复用。grna可以设计成检测多个不同的靶序列。已经描述了基于crispr的多路复用(参见例如quanetal.,2018,“flash:anext-generationcrisprdiagnosticformultiplexeddetectionofantimicrobialresistancesequences,”biorxiv426338；和guetal.,2016“depletionofabundantsequencesbyhybridization(dash):usingcas9toremoveunwantedhigh-abundancespeciesinsequencinglibrariesandmolecularcountingapplications,”genomebiology17:1–13)。2.5步骤5：报道系统和检测旁切活性(切割)38.如上所述，如果隔室中存在核酸靶序列，则cas-grna复合物将结合，导致cas蛋白旁切活性的激活。这种激活(以及，通过推断，靶序列在隔室中的存在)可以被报道系统检测到，当存在旁切活性时，该报道系统会产生可检测的信号。可以使用各种系统。下面提供了两个非限制性示例。在一些方式中，使用双报道系统，其中cas13a切割poly(a)报道分子，其产物激活csm6以切割第二报道分子。参见gootenbergetal.,2018science360:439-444。光学探针39.在一种方式中，淬灭的光学探针用作报道分子。光学探针广泛用于本
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：。通常，探针包含与荧光染料(例如，fam)和淬灭染料(例如，bhq1)缀合的核酸部分(可由crispr切割的其他部分)。cas内切核酸酶对探针的切割(水解)导致染料分离和可检测到的荧光增加。检测ph值变化或其他化学变化40.在一种方式中，cas核酸内切酶活性引起可以被电传感器检测到的化学变化。例如，在一种方式中，cas旁切活性的存在会产生可由cmos传感器检测到的ph变化。在一种方法中，检测ph变化涉及两个酶促反应。例如，在第一步中，cas(例如，cas13)与靶rna结合并在隔室中切割rna分子，产生rna2',3'-环状磷酸酯。在接下来的步骤中，rna2',3'-环状磷酸二酯酶在产生氢离子(h )的过程中将rna2',3'-环状磷酸酯转化为rna2'-磷酸酯。[h ]的增加可以使用ph传感器(例如离子敏感场效应晶体管(isfet)，可从winsenseco.ltd(bangkokthailand)获得)检测。隔室和grna的相关性[0041]信号检测/记录顺序可以是顺序的或并行的。对于顺序成像或cmos检测，液滴必须及时通过检测区域并与grna相关联，或者相机必须按顺序扫描微孔。对于并行检测，与阴性对照相比，相机必须覆盖更大的区域以容纳足够的液滴或微孔，或者单个液滴/微孔具有用于信号变化检测的单个传感器(例如cmos、ccd)。可以顺序或同时检测来自多个隔室的信号。***[0042]尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和示例的方式对前述发明进行了一些详细的描述，但是本领域技术人员应理解在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。此外，本文提供的每篇参考文献均以引用方式全文并入，其程度与每篇参考文献单独以引用方式并入的程度相同。在本技术与本文提供的参考文献之间存在冲突的情况下，应以本技术为准。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：2.一种基于crispr的测定法，其用于使用微流体设备从临床或非临床样品中检测多达数千个感兴趣的核酸靶。
背景技术：
：：3.crispr/cas技术正在彻底改变功能基因组学领域，因为它允许精确的基因编辑。最近研究人员发现，cas蛋白在与靶结合后可以随意切割核酸，这被称为cas“旁切”活性(“collateral”activity)。具有旁切切割特性的cas蛋白可用于开发快速和灵敏的基于crispr的诊断测试，以检测来自病原体或其他核酸靶的核酸。例如，gootenbergetal.,2017,“nucleicaciddetectionwithcrispr-cas13a/c2c2,”science356:438-442，报道称cas13可以在正确识别靶后不加选择地切割单链(ss)rna。cas14在与其ssdna或dsdna靶结合后还显示出切割ssdna的旁切活性。参见harringtonetal.,2018,“programmeddnadestructionbyminiaturecrispr-cas14enzymes,”science362:839-842。两个研究小组独立发现了cas12a/cpf1的旁切ssdna切割活性(lietal.,2018,“crispr-cas12a-assistednucleicaciddetection,”celldiscov4,20；和chenetal.,2018,“crispr-cas12atargetbindingunleashesindiscriminatesingle-strandeddnaseactivity,”science2018:436-439)。4.已经开发了基于cas旁切活性的检测测定法，包括基于cas13的测定法(“sherlock”；参见，例如，gootenbergetal.,2018,“multiplexedandportablenucleicaciddetectionplatformwithcas13,cas12a,andcsm6”science360:439-444,以及基于cas12a的检测(“detectr”；seechenetal.,2018,同上)。还参见lietal.,2019,“crispr/cassystemstowardsnext-generationbiosensing”trendsinbiotechnology37:7:730-743；以及sashital,2018,“pathogendetectioninthecrispr-casera,”genomemed.10:32。所有引用的参考文献均以引用方式全文并入本文以用于所有目的。技术实现要素：5.本发明公开了一种感兴趣的核酸靶的检测方法，所述核酸靶例如来自病原微生物的核酸、变异基因序列和其他靶dna或rna。附图说明6.图1说明了本发明的一实施方案。图例1说明了从样品中提取核酸(例如，分离dna和/或rna)。在该图示中，进行测定法以确定样品中是否存在编码靶1(t1)、靶2(t2)、靶3(t3)和靶4(t4)中的一者或多者的核酸。该图将基因组dna(gdna)、循环胎儿dna(cfdna)和cdna确定为非限制性示例。图例2说明了各种靶的扩增。在该图示中，靶1和3被扩增，靶2和4未被扩增(例如，样品中不存在)，并且产生了其他靶和/或非靶扩增子。图例3通过将扩增的拷贝均等分成等分试样(例如液滴、微孔、分区)并引入靶特异性向导rna、cas蛋白和其他试剂以及报道分子来说明隔室化。图例4说明在含有对目标1特异的grna的隔室中，通过激活旁切活性而产生信号，这表明在样品中存在靶1。图例4说明在包含对靶2特异的grna的隔室中没有产生信号，这表明在样品中不存在靶2。可以顺序或同时检测来自多个隔室的信号。示例性信号是光信号和ph信号。具体实施方式1、概述7.为了说明而非限制，图1描述了本发明的一种方式，其包括以下步骤：8.步骤1：任选地从怀疑含有感兴趣的核酸靶的样品中提取核酸。9.步骤2：任选地扩增核酸，包括如果存在于样品中的感兴趣的靶。10.步骤3：使用微流体技术(微流体通道的分区、电润湿液滴、通道中的液滴封装等)将来自样品的核酸或来自步骤2的扩增产物(扩增子)(包括感兴趣的核酸靶的拷贝)分配到微隔室(例如，微孔、液滴或微流体室)。11.步骤4：将每个微隔室中的核酸底物(核酸和/或扩增子)暴露于反应条件(例如，与包括cas蛋白、指导核酸(grna)和报道系统(例如，报道寡核苷酸)在内的试剂组合)。如果核酸靶序列存在于隔室中，则cas-grna复合物将结合，导致在隔室中cas蛋白旁切活性的激活和报道系统的激活(例如，报道寡核苷酸的切割)。12.步骤5：隔室中的报道系统的激活(例如，报道寡核苷酸的切割)导致可检测信号的产生或变化。检测到该信号。2.详细分析13.本节提供额外的细节和非限制性示例。2.1步骤1：从怀疑含有一个或多个感兴趣的核酸靶的一份或多份样品中提取核酸。14.样品可以是任何含有核酸(例如，dna或rna)并怀疑含有一种或多种靶核酸序列的材料。合适的样品包括临床样品(例如血液、尿液、脑脊液等)、农业样品、环境样品、食品样品等。15.样品中的核酸可以是dna和/或rna，包括例如来自人类或非人类动物的核酸、来自植物或真菌的核酸、来自原核生物或原核生物群体的核酸、以及它们的混合物。所检测的靶核酸可以是基因组dna、线粒体dna、mrna、rrna或cdna。在一种方式中，核酸来自微生物或微生物群体(例如，微生物组，例如肠道微生物组)。在某些情况下，核酸来自病原体。在一种方式中，样品包含来自多种来源的核酸，例如来自多个患者的合并核酸、包含胎儿和母体核酸两者的母体样品、包含循环肿瘤dna的患者样品或包含来自真核生物(例如人类)和原核生物(例如微生物组细菌或致病细菌)的核酸的样品。16.可以在不纯化或富集核酸的情况下分析样品。替代地，可以在扩增之前纯化核酸(与样品的非核酸组分部分地或基本上分离)。用于核酸纯化的方法是本
技术领域：
：公知的。在另一种方式中，可以在扩增步骤之前富集靶核酸。例如，可以使用杂交捕获(或“杂交富集”)方法分离感兴趣的特定序列(靶核酸)或定义的序列类别(例如，外显子dna)。参见，例如gaudin,m.andchristelle,d.,2018,“hybridcapture-basednextgenerationsequencinganditsapplicationtohumaninfectiousdiseases,”frontiersinmicrobiology9:2924。17.在扩增之前、同时或之后，可以对来自样品的核酸进行操作、修饰或转化。例如，可以使用来自样品的rna来制备cdna。作为另一示例，衔接子可以掺入核酸(例如，cdna、rna或感兴趣的扩增子)中。在一种方式中，t1-t4可以是由来自病原细菌的核糖体rna制成的cdna，并且包括特异性识别病原体的序列。在一种方式中，t1-t4可以是编码由某些细菌携带的耐药性标记的dna序列。样品核酸或扩增子的浓度可以在隔室化或其他步骤之前(例如，通过稀释)调整。2.2步骤2：从样品中扩增核酸靶18.在一些方式中，可以在检测之前扩增核酸靶序列。替代地，可以在没有扩增的情况下进行测定。在这种方式中，通常在缓冲液中的样品或分离但未扩增的核酸可以分配到微隔室中。为方便起见，扩增和未扩增的靶核酸可称为“底物靶核酸”。19.许多核酸扩增方法是本领域已知的并且可以用于本发明。扩增通常在下文讨论的隔室化步骤之前进行。当进行扩增时，扩增可以是靶向扩增，也可以是非靶向扩增。“靶向扩增”是指一种或多种特异性靶序列的优先扩增。例如，可以使用被设计用于扩增具有存在的特异性序列的核酸的引物组合进行pcr或rt-pcr(逆转录pcr)。靶向扩增的方法包括使用定义的引物进行pcr、rt-pcr、rpa或rt-rpa(重组酶聚合酶扩增)或nasba(基于核酸序列的扩增)。例如，多个引物对可用于(例如，使用pcr)扩增来自样品的多个靶序列。参见，例如，美国专利no.7,666,598；deimanetal.,2002,."characteristicsandapplicationsofnucleicacidsequence-basedamplification(nasba)".mol.biotech.20:163–180。在一种方式中，多重扩增(例如多重pcr)在容器中进行，并且含有扩增子产物的扩增反应混合物被分配到隔室中。20.在一些实施方案中，扩增是非靶向扩增，例如全基因组扩增(wga)。在一些情况下，非靶向扩增在逆转录步骤之后进行。示例是dop-pcr、malbac、mda、nasba和lianti。参见，例如，teleniusetal.,1992,"degenerateoligonucleotide-primedpcr:generalamplificationoftargetdnabyasingledegenerateprimer,"genomics13,718–725；deanetal.,2002,"comprehensivehumangenomeamplificationusingmultipledisplacementamplification"pnas99:5261-5266；zongetal.,2012,"genome-widedetectionofsingle-nucleotideandcopy-numbervariationsofasinglehumancell,"science338:1622–1626和chenetal.,2017,"single-cellwhole-genomeanalysesbylinearamplificationviatransposoninsertion(lianti)"science356:189–194。21.扩增步骤可以在管(例如，eppendorf管或pcr条)中、在微流体芯片、液滴或任何其他合适的隔室化平台上进行。在微流体芯片的情况下，扩增步骤可以与隔室化步骤(步骤3)集成到单个芯片中。同样，在液滴平台中，可以在一个微流体液滴中进行扩增；然后将内容物(例如，用缓冲液)稀释并分成不同的液滴，每个液滴中具有相同数量和类型的模板。22.扩增可以产生rna扩增子或dna扩增子。不同的扩增可以与不同的检测方法相结合，部分取决于扩增子是dna还是rna。2.3步骤3：将扩增子或靶核酸分配到隔室中23.在扩增之后，扩增产物，包括感兴趣的核酸靶的拷贝，被分配或分成等分试样或微隔室。示例性的微隔室包括但不限于微孔、微室和微滴。用于这种隔室化的微流体设备和方法是本领域已知的，其包括但不限于：·自动移液到微孔中；·使用自填充微孔阵列(参见例如，kangetal.,2010,“cellconfinementinpatternednanoliterdropletsinamicrowellarraybywiping,”jbiomedmaterres93:547–557)·使用微流体通道分配到微室中(参见，例如，fluidigmcorp.的美国专利no.7,476,363和no.8,591,834)；·分散成液滴(参见，例如，bectondickinsonandco.的us20190331585a1)；·将具有不同crispr-cas/grna组合的液滴与包含单个靶扩增子的液滴组合；·电润湿液滴(参见，例如，advancedliquidlogicinc.的us8716015b2)；·通道中的液滴封装(参见，例如，芝加哥大学的us9477233b2)。应当理解，上述分隔或等分技术是为了说明，但本发明不限于特定的分隔方法。24.优选地，在每个隔室包含大约相同体积的扩增子溶液的意义上，将样品均分。理想的是各个隔室包含大约相同数量和类型的核酸底物，以便隔室之间的主要变量是存在的grna。每个隔室的体积范围可以从皮升到微升(例如，100皮升到500微升，例如100到1,000皮升、1到100纳升、100纳升到10微升、或10微升到500微升)。隔室的数量通常多于10个并且可以在10到106个的范围内，例如10到10,000、10到100、100到10,000或1,000到10,000)。2.4步骤4：底物核酸与试剂组合25.每个隔室中的底物(扩增子或未扩增的核酸)可以与试剂组合以进行测定。即，在微隔室中提供包含核酸(包括模板，如果存在)和测定试剂的测定。测定试剂包括(1)cas蛋白，(2)向导rna(grna)，(3)报道系统(例如报道寡核苷酸)，以及(4)缓冲液、辅因子和其他辅助试剂。26.用于将试剂与靶核酸组合的过程将根据微流体平台而变化。示例性平台和方法在上文第2.3节中进行了描述。例如，在基于微孔的平台中，试剂和底物核酸可以通过将单个试剂和试剂混合物自动移液到每个孔中来组合。27.可以以任何顺序或组合添加试剂，只要避免过早激活cas旁切活性即可。通常将多种不同的grna与等分的cas蛋白混合以允许组装cas-grna核糖核蛋白(rnp)复合物。在某些情况下，在添加报道系统部件之前，将cas和grna混合以组装rnp复合物。在这种情况下，可以将组装好的rnp添加到具有相同数量和类型的模板的各个样品隔室中。cas、grna、激活模板序列和报道系统都存在(例如，在隔室或等分试样中)的条件可以称为“完整测定”。28.如果隔室包含被该隔室中的cas蛋白/grna复合物识别的靶核酸序列，则cas-grna复合物将结合靶并且将激活cas蛋白旁切活性。通过在每个隔室中提供报道系统(例如，报道寡核苷酸)，可以检测到隔室中cas蛋白旁切活性的激活。在一种方式中，隔室中的报道寡核苷酸被切割并检测到切割，这表明包含靶序列的多核苷酸存在(或曾经存在)于隔室中。29.应当理解，在一些多路复用实施方案中，通过使用多个不同的grna来测定多个靶序列。通过改变grna中的互补序列(通常为17-25bp)，可以在不同的隔室中测定感兴趣的不同的核酸靶或不同的区域。在某些平台中，需要将每个隔室(例如，孔或液滴)与隔室中包含的grna相关联。在一种方式中，在隔室的gdna含量可基于隔室的位置来确定的意义上，grna是可寻址的。这样，从任何特定隔室检测到的信号可以对应于该隔室中的grna，从而允许用户将来自特定隔室的信号解释为该隔室包含对应于grna序列的靶序列的指示。在一种方式中，在已知(可寻址)位置(例如阵列中的微孔)的各个隔室中具有特异性grna，因此来自任何位置的信号变化都可以与grna含量相关联。可以根据空间信息(例如，通过拍摄阵列中微孔的荧光图像)记录信号变化。替代地，可以记录依次通过检测器的各个隔室(例如液滴)的信号。在液滴平台的情况下，使用适当设计的微流体电路和程序，可以产生含有预定的已知grna的液滴。在这种方式中，来自任何液滴的信号都可以与液滴的已知grna含量相关联。可以包括没有扩增模板或没有grna的阴性对照。2.4.2cas蛋白30.在某些实施方案中，扩增子是dna，并且cas蛋白具有识别dna的旁切活性(即，旁切活性是dnase活性)。在一些实施方案中，cas蛋白是cas12a或cas14或其他dna识别cas蛋白。dna扩增子和dna识别cas蛋白31.产生dna扩增子的扩增方法可用于具有dna切割旁切活性的cas蛋白(例如，cas12a或cas14)。产生dna扩增子的扩增方法的示例包括dop-pcr、malbac和mda。参见teleniusetal.,1992,"degenerateoligonucleotide-primedpcr:generalamplificationoftargetdnabyasingledegenerateprimer,"genomics13,718–725；deanetal.,2002,"comprehensivehumangenomeamplificationusingmultipledisplacementamplification"pnas99:5261-5266；zongetal.,2012,"genome-widedetectionofsingle-nucleotideandcopy-numbervariationsofasinglehumancell".science338:1622–1626。rna扩增子和rna识别cas蛋白32.产生rna扩增子的扩增方法可用于具有rna消化旁切活性的cas蛋白(例如，cas13)。扩增可以包括逆转录和/或转录步骤。一种合适的扩增方法是通过转座子插入的线性扩增(lianti)，它产生ssrna。参见chenetal.,2017,"single-cellwhole-genomeanalysesbylinearamplificationviatransposoninsertion(lianti)"science356:189–194。其他rna扩增方法包括nasba(基于核酸序列的扩增)和lamp(环介导的等温扩增)。一般cas蛋白33.任何合适的具有旁切活性的cas蛋白可以与合适的grna组合用于本文所述的测定的实践中。表1提供了casgrna复合物识别的靶的示例以及旁切核酸酶活性的示例性底物。使用标准测定，熟练的从业者能够识别具有旁切活性的cas蛋白。参见，例如，chenetal.,lietal.,gootenbergetal.,和harringtonetal.，均同上。诸如最佳温度、底物、ph等测定条件对于各种cas蛋白是已知的和/或由熟练的从业者容易地确定。在某些情况下，cas蛋白来自cas12家族(包括cas12a和天然存在的cas12蛋白的工程形式或变体)。在某些情况下，cas蛋白来自cas13家族(包括cas13a/c2c2和天然存在的cas13蛋白的工程形式或变体)。在某些情况下，cas蛋白来自cas14家族(包括天然存在的cas14蛋白的工程形式或变体)。表11.lietal.,2018,supra；chenetal.,2018,同上。2.gootenbergetal.,2018,同上。3.harringtonetal.,2018,同上。2.4.3向导rna(grna)和crispr多路复用34.为了使cas蛋白-grna复合物结合dna，可以使用包含与靶序列互补的序列的grna。通常，互补序列之后是靶链上的相邻原型间隔序列(protospacer)或“pam”序列。cas蛋白-grna复合物可以只包含crrna(其包含结合靶序列中的特异性序列的向导rna)或包含该crrna与tracrrna。替代地，该复合物可以包含cas和单个向导rna(sgrna)，其中crrna和tracrrna都融合在单个分子中。为方便起见，在本公开中，所有sgrna、crrna和crrna/tracrrna都可以称为“grna”。35.同样，为了使cas蛋白-grna复合物结合rna，可以使用包含与靶序列互补的序列的grna。36.用于grna设计的各种方法是本
技术领域：
：已知的并且可以用于本发明。37.在本发明中可以通过在同一隔室中使用多路复用组的grna来实现多路复用。grna可以设计成检测多个不同的靶序列。已经描述了基于crispr的多路复用(参见例如quanetal.,2018,“flash:anext-generationcrisprdiagnosticformultiplexeddetectionofantimicrobialresistancesequences,”biorxiv426338；和guetal.,2016“depletionofabundantsequencesbyhybridization(dash):usingcas9toremoveunwantedhigh-abundancespeciesinsequencinglibrariesandmolecularcountingapplications,”genomebiology17:1–13)。2.5步骤5：报道系统和检测旁切活性(切割)38.如上所述，如果隔室中存在核酸靶序列，则cas-grna复合物将结合，导致cas蛋白旁切活性的激活。这种激活(以及，通过推断，靶序列在隔室中的存在)可以被报道系统检测到，当存在旁切活性时，该报道系统会产生可检测的信号。可以使用各种系统。下面提供了两个非限制性示例。在一些方式中，使用双报道系统，其中cas13a切割poly(a)报道分子，其产物激活csm6以切割第二报道分子。参见gootenbergetal.,2018science360:439-444。光学探针39.在一种方式中，淬灭的光学探针用作报道分子。光学探针广泛用于本
技术领域：
：。通常，探针包含与荧光染料(例如，fam)和淬灭染料(例如，bhq1)缀合的核酸部分(可由crispr切割的其他部分)。cas内切核酸酶对探针的切割(水解)导致染料分离和可检测到的荧光增加。检测ph值变化或其他化学变化40.在一种方式中，cas核酸内切酶活性引起可以被电传感器检测到的化学变化。例如，在一种方式中，cas旁切活性的存在会产生可由cmos传感器检测到的ph变化。在一种方法中，检测ph变化涉及两个酶促反应。例如，在第一步中，cas(例如，cas13)与靶rna结合并在隔室中切割rna分子，产生rna2',3'-环状磷酸酯。在接下来的步骤中，rna2',3'-环状磷酸二酯酶在产生氢离子(h )的过程中将rna2',3'-环状磷酸酯转化为rna2'-磷酸酯。[h ]的增加可以使用ph传感器(例如离子敏感场效应晶体管(isfet)，可从winsenseco.ltd(bangkokthailand)获得)检测。隔室和grna的相关性[0041]信号检测/记录顺序可以是顺序的或并行的。对于顺序成像或cmos检测，液滴必须及时通过检测区域并与grna相关联，或者相机必须按顺序扫描微孔。对于并行检测，与阴性对照相比，相机必须覆盖更大的区域以容纳足够的液滴或微孔，或者单个液滴/微孔具有用于信号变化检测的单个传感器(例如cmos、ccd)。可以顺序或同时检测来自多个隔室的信号。***[0042]尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和示例的方式对前述发明进行了一些详细的描述，但是本领域技术人员应理解在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。此外，本文提供的每篇参考文献均以引用方式全文并入，其程度与每篇参考文献单独以引用方式并入的程度相同。在本技术与本文提供的参考文献之间存在冲突的情况下，应以本技术为准。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
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