含有氧敏发光体的培养装置及其使用方法与流程

含有氧敏发光体的培养装置及其使用方法


背景技术：

1.文章“利用快速干燥液体绷带对皮肤氧合进行非侵入性透皮二维映射(non-invasive transdermal two-dimensional mapping of cutaneous oxygenation with a rapid drying liquid bandage)”(li等人)公开了绷带的氧依赖性磷光发光已经用于定量并映射po2和氧气消耗以及下层组织的氧气消耗两者。
2.文章“pt-乙炔化物低聚物、聚合物和共聚物中的三重态(the triplet state in pt-acetylide oligomers,polymers and copolymers)”(silverman等人)公开了铂乙炔化物低聚物和聚合物是从三重态激子显示发光的π-共轭材料。
3.文章“共轭聚合物扩增的感测、成像和疗法(conjugated-polymer-amplified sensing,imaging,and therapy)”(wu等人)公开了共轭聚合物是用于扩增检测特征的关键平台，这些检测特征预示生物标志物的存在。
4.文章“对氧化进入的不可逆感测(irreversible sensing of oxyen ingress)”(wilhelm等人)公开了两种不同的基于吸收的不可逆但可再生的光学氧气探针。
5.us3338794公开了用于培养厌氧微生物的低价的一次性装置，其在温育期之前不需要使用昂贵且耗时的技术来去除氧气。
6.us20180312895公开了一种用于对微生物菌落计数的装置。设置在装置的生长隔室内的是冷水溶性胶凝剂、干燥除氧剂、干燥缓冲体系和有效量的干燥二氧化碳生成剂。
具体实施方式
7.在整个本公开中，为方便起见，常常使用单数形式例如“一种”、“一个”和“该/所述”；然而，除非上下文明确规定或清楚指示仅为单数，否则单数形式意指包括复数。当单独称为单数时，通常使用术语“仅仅一个”。
8.本公开中的一些术语定义如下。其他术语对于本领域的技术人员将是熟悉的，并且应当被赋予本领域的普通技术人员将赋予它们的含义。
9.指示高频率的术语诸如(但不限于)“常见的”、“典型的”和“通常的”以及“常见地”、“典型地”和“通常”在本文中用于指本发明经常采用的特征，并且除非明确地对照现有技术使用，否则并不旨在表示这些特征存在于现有技术中，远少于现有技术中那些常见的、通常的或典型的特征。
10.术语“氧敏染料”是指在存在氧气的情况下改变其吸收或发光的光的波长或强度的化学实体。在不存在氧气的情况下既不吸收也不发射光但在存在氧气的情况下吸收或发射光的化合物是一种类型的“氧敏染料”。氧敏发光体(如本文所定义)以及氧敏磷光体(如本文所定义)和比色氧染料(如本文所定义)是氧敏染料的示例。
11.术语“比色氧染料”是指在存在氧气的情况下(与不存在氧气的情况相反)改变其吸收光(特别地紫外光或可见光)的波长(诸如最大吸收的波长或λ
max
)的化学实体。变化无需是可逆的。特定的比色氧染料在不存在氧气的情况下不吸收足够对人眼可见的光，但是在接触时吸收足够对人眼可见的光；其他特定的比色氧染料在不存在氧气的情况下具有第
一λ
max
，并且在接触氧气之后具有第二不同的λ
max
。在任一种情况下，变化可以是可逆的，即如果去除氧气，则比色氧染料可恢复到其氧气接触前状态，或变化为不可逆的。
12.术语“发光体”是指表现出发光的化学实体。
13.术语“氧敏发光体”是指具有在存在氧气的情况下淬灭的发光的发光体。
14.术语“磷光体”是指表现出磷光的发光体。磷光体还可表现出荧光，但这不是必需的。
15.术语“氧敏磷光体”是指具有在存在氧气的情况下淬灭的磷光的磷光体。如果磷光体表现出荧光，则荧光也可因氧气的存在而淬灭，但这不是必需的。
[0016]“除氧体系”是指被设计成消耗培养装置的生长隔室内的氧气(通常基本上全部的氧气)的化学、生物或机械体系，其可以是酶或其他化学体系。然而，除氧体系不包含在培养装置上，诸如在培养装置的生长隔室中培养的微生物。
[0017]
动词“淬灭”及其变型意指致使发光强度降低；当与磷光体或磷光相关联使用时，其更特别地意指导致磷光强度降低。因此，如果磷光体被氧气淬灭，则磷光体的磷光的强度随着氧气分压的增加而降低。
[0018]
本公开认识到，在培养和检测微生物的技术中，存在问题，因为通常有必要对正在培养的微生物染色或以其他方式赋予颜色。即使不需要染色，也可能有必要依赖于检测微生物的固有颜色。在任一种情况下，检测依赖于在培养装置外部的光源，诸如检测器中的灯或其他照明源。这增加了检测器的成本，检测器必须不仅被构建为具有用于为培养装置照明的专用灯，而且也必须装配成能够重复地提供相同的照明条件以便提供一致的结果。当要对微生物计数时，问题甚至更加困难，因为照明条件必须是高度可重复的，以确保计数正确。
[0019]
相关问题是如何使用氧敏染料来检测培养的微生物，并且更特别地对培养的微生物计数。
[0020]
相关问题是如何使用发射光来检测培养的微生物，并且更特别地对培养的微生物计数。
[0021]
本公开还识别出气敏磷光体，并且更特别地氧敏磷光体领域的问题。因此，另一个问题是如何使用氧敏发光体(更特别地氧敏磷光体)来检测培养的微生物的存在。相关问题是如何使用含卟啉材料来检测培养的微生物，并且更特别地对培养的微生物计数。
[0022]
本公开还识别出比色氧染料领域的问题。因此，另一个问题是如何使用比色氧染料来检测培养的微生物的存在。
[0023]
这些问题和相关问题通过使用如本文所述的培养装置来解决。培养装置具有被一个或多个不透氧阻挡层包围的生长隔室。不透氧阻挡层中的至少一个不透氧阻挡层能够在开式配置与闭合配置之间进行装配。在开式配置中，生长隔室接触在生长隔室外部的环境。在闭合配置中，生长隔室被密封，不与在生长隔室外部的环境交换氧气。
[0024]
培养装置还包括能够支持设置在生长隔室内的至少一种微生物的复制的培养基。氧敏染料(特别地比色氧染料或氧敏发光体，并且更特别地氧敏发光体)也设置在生长隔室内。
[0025]
培养装置以及本文所述的方法的各种实施方案可用于解决前述问题和其他问题。
[0026]
在本文所述的培养装置中的任何培养装置中，该一个或多个不透氧阻挡层可以是
3m
tm
petrifilm
tm
乳酸菌计数板(购自美国明尼苏达州圣保罗的3m公司(3m company,st.paul mn,usa))中采用的那些。不透氧阻挡层可包含诸如以下材料：聚乙烯(例如低密度聚乙烯、线性低密度聚乙烯等)、箔(诸如铝箔)和本领域已知的其他不透氧材料；一种材料或材料的组合可用于产生不透氧阻挡层。
[0027]
与前述培养装置中的任何培养装置相关，不透氧阻挡层中的至少一个不透氧阻挡层有利地包括盖片。在存在盖片的任何培养装置中，开式配置可以是其中盖片位于生长隔室上的配置，并且闭合配置可以是其中盖片至少部分地与生长隔室脱离的配置。
[0028]
在前述培养装置中的任何培养装置中，端口可存在于该一个或多个不透氧阻挡层中的至少一个不透氧阻挡层中，使得端口可在开式配置与闭合配置之间转换。例如，当端口处于开式配置时，可将生长隔室接种，之后可关闭端口。
[0029]
关于前述培养装置中的任何培养装置，培养基可以是任何类型的培养基并且可根据要培养的微生物的类型、要使用的检测方法或其他实际考虑而变化。例如，在培养装置的前述实施方案中的任何实施方案中，培养基可以是薄膜培养基，并且更特别地是冷水胶凝薄膜培养基。这种类型的培养基是可商购获得的，诸如以petrifilm
tm
品牌由美国明尼苏达州圣保罗的3m公司(3m company st.paul mn usa)出售的那些。作为替代方案，琼脂可用作前述培养装置中任何培养装置中的培养基。
[0030]
关于本文所述的培养装置中的任何培养装置，可使用任何合适的氧敏染料。氧敏染料的示例包括比色氧染料和氧敏发光体。
[0031]
氧敏发光体是可以采用的特定氧敏染料。关于本文所述的培养装置中的任何培养装置，氧敏发光体可以是被氧淬灭的任何发光体。有利地，在任何培养装置中，氧敏发光体是氧敏磷光体。关于任何前述培养装置，氧敏磷光体可有利地包含卟啉或π-共轭分子或π-共轭聚合物中的至少一者。关于本文所述的培养装置中的任何培养装置，氧敏磷光体可包含树状高分子。关于本文所述的培养装置中的任何培养装置，氧敏磷光体可包含卟啉。关于本文所述的培养装置中的任何培养装置，氧敏磷光体可包含π-共轭分子。在采用π-共轭分子的本发明所公开的培养装置中的任何培养装置中，π-共轭分子有利地包含用于过渡金属或镧系元素的π-共轭配体。这些分子的示例包括铱(iii)或铂(ii)的环金属化络合物，特别地吡啶诸如2-取代的吡啶，特别地芳基或环芳基吡啶，并且甚至更特别地铱(iii)或铂(ii)的苯基吡啶络合物。其他示例包括基于吡啶的络合物，并且更特别地钌(ii)、锇(ii)或铼(ii)的聚吡啶基络合物。在其中采用π-共轭配体的培养装置中的任何培养装置中，π-共轭配体可以是联吡啶。所谓的“联吡啶”意指联吡啶部分存在于分子中，但其他部分可能或可能不另外存在，并且在存在其他部分的情况下，其他部分直接或间接结合到联吡啶部分。在其中采用π-共轭配体的培养装置中的任何培养装置中，π-共轭配体可以是乙炔化物。在其中采用乙炔化物的培养装置中的任何培养装置中，乙炔化物可以是亚苯基乙炔或聚亚苯基乙炔。所谓的“亚苯基乙炔”或“聚亚苯基乙炔”意指亚苯基乙炔或聚亚苯基乙炔部分存在于分子中，但其他部分可能或可能不另外存在，并且在存在其他部分的情况下，其他部分直接或间接结合到亚苯基乙炔或聚亚苯基乙炔部分。在其中采用π-共轭配体的培养装置中的任何培养装置中，π-共轭配体可以是卟啉。在其中采用π-共轭配体的培养装置中的任何培养装置中，π-共轭配体可以是树状高分子。有利地，在其中采用π-共轭配体的培养装置中的任何培养装置中，π-共轭配体可以是含有卟啉的树状高分子。
[0032]
关于本文提及的培养装置中的任何培养装置，金属可与氧敏发光体结合，该氧敏发光体可以是本文提及的氧敏发光体中的任何氧敏发光体，并且更特别地π-共轭分子。关于其中金属与π-共轭分子结合的任何情况，金属有利地是过渡金属或镧系元素，但也可使用其他金属，诸如锕系元素。当金属与π-共轭分子结合时，最常使用过渡金属。在金属与任何发光体结合的任何培养装置中，结合可通过任何类型的化学相互作用，诸如连接、共价键合、离子键合、范德瓦尔斯相互作用等。
[0033]
关于迄今为止提及的培养装置中的任何培养装置，在采用时，与π-共轭分子结合的过渡金属有利地选自钯、铂、铼或钌。然而，应当理解，也可以使用其他过渡金属。在其中使用镧系元素的任何培养装置中，镧系元素中最常见的是铱。应当理解，在其中氧敏磷光体包含金属的所有情况(包括金属是过渡金属、镧系元素或其他金属如钯、铂、铼或钌或铱的情况)下，金属可处于提供氧敏磷光体的任何氧化态，并且不一定处于零氧化态。
[0034]
当乙炔化物在本文所述的任何培养装置中用作π-共轭配体时，乙炔化物有利地与铂金属结合。
[0035]
特别地在任何本文所述的培养装置中，可使用含有卟啉的氧敏磷光体。在采用含有卟啉的氧敏磷光体的培养装置中的任何培养装置中，卟啉可与金属结合，诸如上文所论述的金属中的任何金属。本文所公开的任何培养装置中含有卟啉的氧敏磷光体可以是卟啉树状高分子。最特别地，在本文所述的任何培养装置中，卟啉树状高分子可与金属配位，金属特别地是过渡金属或镧系元素，并且最特别地为铂或钯。已经公开了含有卟啉的树状高分子。可在前述培养装置中的任何培养装置中使用的特定含有卟啉的树状高分子是pd-meso-四(4-羧基苯基)卟啉树状高分子，其是本领域已知的并且可通过本领域公认的方法制备。还可根据本领域公认的方法制备其他卟啉和含有卟啉的树状高分子以及本文所述的与培养装置一起使用的其他类型的氧敏磷光体。
[0036]
可使用的氧敏磷光体的其他示例包括但不限于磷光al(iii)-ferron络合物、磷光硼络合物、稀土元素的络合物或其盐、cu(i)、au(i)等。
[0037]
不是发光体的氧敏染料包括但不限于隐色形式靛蓝染料、隐色形式硫靛蓝染料、双(组氨酸)钴的一种或多种络合物、meso-四(α-α-α-α-o-新戊酰氨基苯基)卟啉钴和富勒烯(诸如巴克明斯特富勒烯)。其他示例包括多环芳族化合物，诸如1-芘癸酸和十环烯。
[0038]
在本文所述的培养装置中的任何培养装置中，前述氧敏染料中的任何氧敏染料，并且特别地前述氧敏发光体中的任何氧敏发光体可设置在培养基内。
[0039]
在前述培养装置中的任何培养装置中，粘合剂可存在于生长隔室内，并且在存在粘合剂的任何情况下，本文所述的氧敏染料或发光体中的任一者可设置在粘合剂内或设置在粘合剂上。
[0040]
可含有前述氧敏染料(并且特别地氧敏发光体)中的任一者的前述培养装置中的任何培养装置将有利地在生长隔室内不含有除氧体系。如上所述，不认为要培养的微生物(诸如可用于接种本文所述的任何培养装置的微生物)是本公开中的除氧体系。在本文所述的培养装置中的任何培养装置中，一定体积的氧气有利地存在于生长隔室的空气内。特别地，当生长隔室设置在闭合配置时，生长隔室内的空气不能与生长隔室外部的空气连通。因此，生长隔室内被耗尽的任何氧气不能通过氧气从生长隔室的外部扩散到生长隔室的内部而恢复。
[0041]
在使用中，可含有本文所述的氧敏发光体中的任何氧敏发光体的前述培养装置中的任何培养装置可以开式配置提供，并且接种有样品的生长隔室含有一种或多种微生物。在任何使用方法中，样品可以是可添加到生长隔室中的液体样品，特别地含水液体样品。另选地，在任何使用方法中，样品可以是拭子样品，例如位于吸收性拭子上的样品，其可通过使拭子与生长隔室内的培养基接触来接种生长隔室。
[0042]
关于可与本文所述的培养装置中的任何培养装置一起使用的本文所述的方法中的任何方法，微生物可以是消耗氧气的任何微生物。通常，这意味着微生物是需氧微生物或兼性厌氧微生物。然而，还可以使用本文所述的方法来培养微需气细菌。
[0043]
接种后，可将培养装置转换成闭合配置。在闭合配置中，生长隔室最初具有不与在生长隔室外部的环境不同的氧含量，该氧含量可被称为或测量为例如氧气分压。这是因为在接种步骤期间培养装置装配成处于开式配置。
[0044]
然后将培养装置温育足够长的时间并且在足够高的温度下温育，使得氧敏染料(其可以是前述氧敏染料中的任何氧敏染料，并且特别地前述氧敏发光体中的任何氧敏发光体)发生吸收或发光的变化，在氧敏发光体的情况下这种变化通常是氧敏发光体的发光。时间和温度将根据正在培养的特定微生物而变化。典型的时间为一小时至七天，并且典型的温度为20℃至60℃。当氧敏染料是氧敏磷光体，并且特别地上文提及的氧敏磷光体中的一种氧敏磷光体时，氧敏磷光体发磷光。
[0045]
不受理论的束缚，随着接种在生长隔室中的一种或多种微生物呼吸并繁殖，它们可消耗生长隔室内的氧气。因为培养装置处于闭合配置，所以消耗的氧气不能被来自生长隔室外部的氧气替代，因此生长隔室内的氧气分压减小。当分压充分减小时，氧敏染料发生颜色变化，在氧敏发光体，特别地氧敏磷光体的情况下，这种颜色变化包括表现出可检测的发光，诸如磷光。
[0046]
颜色变化，并且特别地发光(诸如磷光)可处于任何可检测的波长并且不需要在可见光谱中。可检测的波长是可由检测器检测的波长。多种光检测器是本领域已知的，并且可根据发光的波长选择合适的检测器，例如电耦装置(ccd)、光电二极管或甚至人眼。当颜色变化是吸收变化时，可通过吸收光谱法诸如uv/vis吸收、ir吸收等测量这种变化。
[0047]
还可以对微生物计数。这可采用上述培养装置或方法中的任何培养装置或方法完成，并且当氧敏染料是均匀地分布在培养基中、粘合剂中或粘合剂上的氧敏发光体时可最简单地进行计数。例如，计数可通过使用检测器诸如ccd相机来执行，以记录培养装置的整个生长隔室的图片，该检测器测量发光的强度、位置或强度和位置两者。然后可例如通过分配强度高于阈值强度的区域以表示菌落来从图片中对菌落形成单位数计数。阈值强度将取决于特定培养装置和微生物，但是将为对微生物和噪声的存在进行区分的强度。也可例如通过确定生长隔室中特定位置处的氧浓度来间接确定生长隔室的任何区域中的氧气浓度。可使用stern-volmer关系计算生长隔室中的任何位置处的氧气浓度，其可与该位置中的微生物的量有关。
[0048]
值得注意的是，这些方法优选地在不将培养装置或更特别地培养装置的生长隔室放置在降低氧气的气氛(诸如手套箱)中的情况下进行。此外，这些方法优选地在不活化培养装置内或更特别地培养装置的生长隔室内的除氧体系的情况下进行。