一种血管化肌肉模型及其制备与应用的制作方法

1.本发明涉及肌肉芯片技术领域，尤其是涉及一种血管化肌肉模型及其制备与应用。


背景技术：

2.骨骼肌是人体最丰富的肌肉类型，约占人体体重的40％，其主要功能是产生收缩力，使得人们可以自由呼吸和运动等等。因此，骨骼肌对人类健康至关重要。在病理条件下，许多疾病都伴随着肌肉功能障碍，如杜氏肌肉萎缩症、幼年肌皮炎、重症肌无力、肌营养不良和阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征等等。探索发病机制、评估药物疗效是治疗肌肉损伤相关疾病的关键。然而目前，传统上临床上新药的发现、开发和毒性分析多基于2d细胞培养和小动物模型来进行临床前试验的，但只有11.8％进入临床试验的药物获得批准，导致新批准药物的平均成本为25亿美元。这种低疗效的部分原因是动物疾病模型不能真正复制人类疾病，以及动物和人之间药物反应和毒性的差异。这就需要我们研发更有效的人仿生肌肉模型，从而加速这一领域的快速发展。
3.人器官芯片堪称将医药、微流控、组织工程和细胞重编程/转分化四大高新领域的重要集成，无论在推进疾病体外模型的发展，药物筛选和评价领域具有重要的应用价值。器官芯片的核心是体外构建器官的核心组织结构，实现器官的关键生理功能。骨骼肌的核心成分是肌纤维(肌细胞)，并有多根毛细血管与肌纤维相伴行，所以说肌肉是高度血管化的组织。生理上，血管不仅仅为肌肉组织提供氧气，支持肌肉收缩，它还可与邻近细胞相互作用来调节骨骼肌微环境稳态。如内皮细胞(endothelial cells,ecs)可与周围细胞相互作用，通过分泌一系列生长因子，如胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子等来促进肌生成和血管新生。然而，目前研究人员在肌肉芯片的搭建过程中，更多关注了肌纤维本身，往往忽略了血管对维持肌肉收缩、调节肌肉微环境稳态所发挥的重要作用。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种血管化肌肉模型及其制备与应用。本发明首先将成肌细胞、内皮细胞、细胞培养液和细胞外基质的替代物混匀得到混悬液；然后将混悬液置于预处理的肌肉芯片中诱导分化得到血管化肌肉模型。本发明实现将肌肉和血管在芯片中共培养，更加仿生肌肉微环境，使得形成的组织无论从形态结构到关键生理功能均与体内更相似，可以更有效的应用于肌肉损伤相关疾病的基础研究和临床药物筛选中，使所获得的研究结果更准确可靠。本发明制备得到的血管化肌肉模型可以广泛应用于肌肉相关疾病的基础研究和药物评价体系。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
6.本发明的第一个目的是提供一种血管化肌肉模型的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将成肌细胞、内皮细胞、细胞培养液和细胞外基质的替代物混匀得到混悬液；
8.(2)将步骤(1)制备得到的混悬液置于预处理的肌肉芯片中诱导分化得到血管化肌肉模型。
9.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述细胞培养液为体积分数为10％fbs和1％ecgs的培养基。
10.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述细胞外基质的替代物包括matrigel胶、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶。
11.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，成肌细胞、内皮细胞、细胞培养液、matrigel胶、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶的用量比为7.5
×
105个：16-18μl：10μl：10μg：0.05u：0.08μg；
12.在本发明的一个实施方式中，成肌细胞与内皮细胞的个数比为3-6：1。
13.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述预处理为将肌肉芯片浸入0.2％-2％f-127中以防止细胞粘附，静置后吸干。
14.在本发明的一个实施方式中，所述f-127的体积分数为0.2％-2％。
15.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，诱导分化过程中，诱导分化时间为7-14天。
16.本发明的第二个目的是提供一种通过上述方法制备得到的血管化肌肉模型。
17.本发明的第三个目的是提供一种血管化肌肉模型在肌肉相关疾病的基础研究和药物评价体系中的应用。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.本发明提供了一种操作简单、重复性好的人血管化肌肉芯片制备方法，其优点是芯片制作方法简单、无需复杂的仪器设备和技术集成，便于在一般研究平台进行推广；芯片可以通过开模注塑加工生成，加工成本低；芯片可拆卸清洗消毒，再重复使用，大幅增加了器官芯片的可重复使用次数。此外，本发明实现将肌肉和血管在芯片中共培养，更加仿生肌肉微环境，使得形成的组织无论从形态结构到关键生理功能均与体内更相似，可以更有效的应用于肌肉损伤相关疾病的基础研究和临床药物筛选中，使所获得的研究结果更准确可靠。
附图说明
20.图1为本发明中制备血管化肌肉芯片所需阴模实物图；
21.图2为本发明中制备血管化肌肉芯片所需硅胶框架实物图；
22.图3为本发明中将硅胶框架置于阴模有哑铃状凹槽的一侧，并用无菌针头固定实物图；
23.图4为本发明中形成的血管化3d肌束实物图；
24.图5为本发明的血管化肌肉芯片形成的肌肉组织在横截面和纵截面的免疫荧光染色图；其中粗箭头表示肌肉，细箭头表示血管；
25.图6为本发明中成肌细胞、内皮细胞在芯片中诱导分化第7天时形成的肌肉的mhc免疫荧光染色图片；
26.图7为本发明形成的血管化肌肉组织在诱导分化第7天后形成的肌纤维直径和分析指数的量化分析图，并与单纯肌肉组织作对比；其中**p《0.01；***p《0.001；
27.图8为本发明中对诱导分化第7天后形成的血管化肌肉进行saa免疫荧光染色，以此来观察肌肉中形成的横纹情况；
28.图9为本发明中形成的血管化肌肉组织中的横纹频率的量化分析图，并与单纯肌肉芯片作对比；其中**p《0.01；
29.图10为检测诱导分化第7天后形成的血管化肌肉的收缩位移量化分析图；并与单纯肌肉芯片作对比；其中**p《0.01；
30.图11为检测在慢性间歇性低氧条件下血管化肌肉芯片中肌肉损伤情况；
31.图12为在慢性间歇性低氧条件下血管化肌肉芯片中肌纤维直径和长度的量化分析图，并与单纯肌肉组织作对比；其中*p《0.05；**p《0.01；
32.图13为构建血管肌肉芯片劳损模型。
具体实施方式
33.本发明提供一种血管化肌肉模型的制备方法，包括以下步骤：
34.(1)将成肌细胞、内皮细胞、细胞培养液和细胞外基质的替代物混匀得到混悬液；
35.(2)将步骤(1)制备得到的混悬液置于预处理的肌肉芯片中诱导分化得到血管化肌肉模型。
36.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述细胞培养液为体积分数为10％fbs和1％ecgs的培养基。
37.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述细胞外基质的替代物包括matrigel胶、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶。
38.在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，成肌细胞、内皮细胞、细胞培养液、matrigel胶、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶的用量比为7.5
×
105个：16-18μl：10μl：10μg：0.05u：0.08μg；
39.在本发明的一个实施方式中，成肌细胞与内皮细胞的个数比为3-6：1。
40.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述预处理为将肌肉芯片浸入0.2％-2％f-127中以防止细胞粘附，静置后吸干。
41.在本发明的一个实施方式中，所述f-127的体积分数为0.2％-2％。
42.在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，诱导分化过程中，诱导分化时间为7-14天。
43.本发明提供一种通过上述方法制备得到的血管化肌肉模型。
44.本发明提供一种血管化肌肉模型在肌肉相关疾病的基础研究和药物评价体系中的应用。
45.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
46.在下面的实施例中，若无特殊说明，所用试剂均为市售试剂；所用检测手段及方法均为本领域常规检测手段及方法。
47.实施例1：构建血管化肌肉芯片模型。
48.制备芯片框架：首先通过3d cad软件solidworks设计两个平行的哑铃状结构；根据软件设计的参数，通过微加工技术在聚四氟乙烯板表面制备哑铃状通道(包括连接通道以及连接通道两侧的端部通道)，形成阳模；两个哑铃状通道的长度、宽度和深度均相同。其
中，连接通道长度为7mm，宽度为2mm，深度为1.5mm；端部通道垂直于连接通道的长度为4mm，平行于连接通道的长度为2mm，深度为1.5mm。相邻哑铃状通道之间的距离为4mm。利用pdms作为阴模材料，将pdms灌注于芯片阳模上，并放于4℃冰箱内静置过夜，排除pdms中的气泡。次日，将其取出放入烘箱内80℃烘烤1小时，pdms凝固，放置室温冷却后，揭膜，此时在聚二甲基硅氧烷板(pdms板)上形成具有两个平行的哑铃状凹槽结构(包括连接凹槽和连接凹槽两侧的端部凹槽)，即阴模(如图1所示)。通过3d cad软件solidworks设计方形外观；根据软件设计的参数，通过微加工技术用硅胶材料制备硅胶框架(设置有方形孔洞的“回”字型框架)，如图2所示。硅胶框架参数为：外边宽度为12mm，长度为11mm；内边宽度为10mm，长度为7mm。上述的参数设置可以保证硅胶框架可与哑铃状凹槽相匹配。将硅胶框架置于阴模有哑铃状凹槽的一侧，通过3号无菌细针头穿插连接起来(如图3所示)放置于细胞培养小皿或者孔板内，无需封接，并一起放置于紫外灯下消毒至少1小时灭菌后，将芯片浸入含有0.2％f-127的溶液中，浸泡1小时，以防止细胞粘。
49.制备混悬液：首先待成肌细胞、血管内皮细胞(huvec)密度达80％以上时，胰酶消化，并计数，c2c12与huvec的比例关系为6：1，并确保最后每个槽内接种细胞总数为7.5
×
105个。其次，制备ecm的替代物：matrigel胶、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶。最终每个凹槽接种混悬液，其中各物质含量如下：17.2μl细胞悬液(细胞数为7.5
×
105个，c2c12：huvec＝6：1) 17.2μl细胞培养液 10μlmatrigel胶 10μl fibrinogen(20mg/ml) 1μl凝血酶(50u/ml) 1μl抑肽酶(80μg/ml)。制备完细胞和ecm替代物的混悬液后，立即将其接种于底面预处理的pdms上，并放置于37℃、5％co2的细胞培养箱内1小时，待基质胶凝固后，加入dmem和ecm细胞混合培养液(两种培养基体积比为1:1)进行3d细胞培养，所述的dmem细胞培养基包含体积浓度为10％fbs和1％双抗，所述ecm培养基中包含体积浓度为5％fbs、1％ecgs和1％双抗。次日即可看见3d细胞与周围脱离，两端粘附在框架上。
50.诱导成肌细胞分化形成肌束：待3d细胞培养3天稳定后，即可更换含有2％马血清的培养基进行诱导分化。每隔一天更换诱导分化的培养基。所述的2％马血清的培养基包含体积浓度为96％dmem、1％ecgs和1％双抗。其中图4为芯片中诱导7天形成的血管化肌束实物图，并与单纯的肌肉组织作对比。
51.实施例2：检测血管化肌肉芯片中形成3d肌束和血管的形态。
52.为了观察诱导肌纤维的成熟情况、血管形态以及与肌纤维与血管的位置关系等情况，我们对血管化肌肉芯片中形成的肌纤维和血管内皮细胞进行mhc和cd31的免疫荧光染色。首先将诱导分化7天血管化肌肉组织放置于2％的pfa中4℃过夜固定；次日弃掉pfa，pbs冲洗3次，每次10分钟；之后将组织进行oct包埋，利用冰冻组织切片机对血管化肌肉组织从横向和纵向两个方向进行切片，并放置于-80℃冰箱内。次日，取出切片放置于37℃烘1小时，放置于pbs中清洗3次，每次5分钟，之后组织上加入含有0.2％triton-100 x的山羊血清封闭液室温封闭1小时；回收封闭液，无需冲洗，加入mhc一抗稀释液(1：10，dshb)，4℃过夜。次日，将样品放于室温复温1小时，回收一抗稀释液，pbs冲洗3次，每次10分钟。再加入cd31一抗稀释液(1：100，abcam)，4℃过夜。之后将样品再放置于室温中复温1小时，回收一抗稀释液，pbs冲洗3次，每次10分钟。加入山羊抗小鼠二抗和山羊抗兔二抗(abcam)，稀释比例均为1：1000，4℃过夜。次日回收二抗，pbs冲洗3次，每次10分钟，加入dapi(1：10000，碧云天)室温孵育15分钟，pbs冲洗3次，每次10分钟。染色结束后，放置于共聚焦显微镜下拍照记录
肌纤维的成熟情况、血管形态和二者的位置关系。由图5可知，成肌细胞在诱导分化7后即形成成熟的肌纤维，血管内皮细胞cd31表达阳性，并依次排列依附在肌纤维上，甚至可以看到类似血管样结构的形态，其中粗箭头指的是肌纤维，细箭头指的是血管。
53.实施例3：检测血管化肌肉芯片中形成肌肉的成熟情况。
54.为了检测血管在促进成肌细胞分化和成熟的作用，将血管化肌肉芯片中形成的组织在诱导分化7天后进行mhc的免疫荧光染色，并与单纯肌肉芯片作对照。首先将诱导分化不同时间点的肌束放置于2％的pfa中4℃过夜固定；次日弃掉pfa，pbs冲洗3次，每次10分钟；之后加入含有0.2％triton-100 x的山羊血清封闭液室温封闭1小时；回收封闭液，无需冲洗，加入mhc一抗稀释液(1：10，dshb)和saa一抗稀释液(1：100，sigma)，4℃过夜。次日，将样品放于室温复温1小时，回收一抗稀释液，pbs冲洗3次，每次10分钟。加入山羊抗小鼠二抗(1：1000，abcam)，4℃过夜。次日回收二抗，pbs冲洗3次，每次10分钟，加入dapi(1：10000，碧云天)室温孵育15分钟，pbs冲洗3次，每次10分钟。染色结束后，放置于共聚焦显微镜下拍照记录成肌细胞的分化情况，并通过量化分析评估肌束的成熟情况。由图6-9可见，相比较于单纯肌肉芯片，血管化肌肉芯片在诱导分化第7天时候即分化良好，形成了成熟的肌纤维，且肌纤维的直径更大，细胞分化指数更高，横纹频率更高，这表明血管在诱导肌纤维成熟中发挥重要作用。
55.实施例4：检测血管化肌肉芯片中形成肌肉的收缩功能。
56.将c2c12细胞、huvec细胞在芯片中诱导分化7天后，将其放置于两端含有铂金电极的电刺激装置中，并施加一定的电刺激。当场强为20v/cm、脉宽为10ms时可以有效刺激肌肉收缩，当给予血管化肌肉芯片进行1hz的电刺激时，血管化肌束组织可以发生单收缩，并通过image j软件量化肌肉组织移动的位移。由图10可见，相比较于单纯肌肉芯片，血管化肌肉芯片中形成的肌肉组织收缩位移更大，这表明血管化肌肉组织形成的收缩力更大，血管内皮细胞在维持肌肉收缩功能具有重要作用。
57.实施例5：将血管化肌肉芯片模型应用于阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征研究中。
58.将c2c12细胞、huvec细胞在肌肉芯片中诱导分化7天后，放置于biospherix(oxycycler，c42，usa)精密控氧系统中，构建慢性间隙性低氧(cih)模型来模型阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的病理生理条件。其中cih条件为1％o2 5％co2(40min)和21％o2 5％co2(20min)。
59.为了检测血管化肌束在cih环境下的损伤情况，将其置于cih环境一天，并对血管化3d肌束进行mhc的免疫荧光染色。免疫荧光染色方法如上述所示，其中mhc的使用浓度为1：10(dshb)。染色结束后将血管化3d肌束放置于共聚焦显微镜下拍照记录肌束的形态，并通过量化分析肌束的损伤情况。图11显示了血管化3d肌束暴露于cih环境一天时肌束形态的变化，并与单纯3d肌束作对比。如在cih环境第一天时，3d肌束的肌纤维开始出现明显的水肿和断裂，而血管化3d肌束的肌纤维并未表现出形态的改变。图12量化分析了肌纤维的直径和长度，结果表明相比较于血管化3d肌束，cih对单纯3d肌束造成的损伤更大，这提示将血管化肌肉芯片应用于阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征中，所得的研究结果可能更准确，与体内更相近。
60.实施例6：将血管化肌肉芯片模型应用于肌肉劳损模型的研究中。
61.将血管化肌肉芯片放置于含有铂金电极的电刺激装置下，每15秒给予血管化肌肉20hz的电刺激，使得血管化肌肉发生强直收缩，从而构建肌肉劳损模型。持续1小时后，对其进行saa免疫荧光染色。步骤同上所述。图13结果显示血管化肌束在持续强直收缩后，肌纤维的横纹减少，肌纤维形态发生肿胀，有的甚至发生溶解消失。其中左图为正常血管化肌肉芯片的saa的染色结果，右为肌肉劳损模型中肌纤维的损伤情况。
62.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。