提高菌株抗逆性的方法及基因在提高菌株抗逆性中的应用

1.本发明涉及一种提高菌株抗逆性的方法以及通过该方法筛选得到的基因在提高菌株抗逆性中的应用，涉及生物工程技术领域。


背景技术：

2.在绿色可持续的经济驱动下，生物制造成为提升21世纪产业化的重要技术。菌株已经用于大宗化学品、医药产品、植物天然产物、生物燃料等一系列物质的生物合成，然而在菌株发酵过程中，经常面临着各种“胁迫因子”，例如高温、酸碱、高渗透压、有机溶剂等，这些胁迫因子会抑制菌株生长代谢及生产性能。传统的消除胁迫方法是控制发酵工艺，但工艺优化耗能过多，不利于低碳、低成本的绿色发展模式，为了能够在实际的生物转化过程中达到节能、减排、降耗、增效、提质的生产特性，菌株除了具有强大的代谢水平外，还应具有抗逆的生理特性；但是，工业菌株抗胁迫能力的不同，导致生产成本差异较大，抗胁迫能力强的菌株无疑更具成本效益，因此，提高菌株对多种胁迫的抗逆性是提高生产效率、降低经济成本的关键。
3.提高菌株胁迫抗逆性的方法包括非理性方法和理性方法，非理性方法包括对基因的随机突变、物理化学诱变以及菌株的实验室适应性进化等，随着合成生物学技术的不断发展，也通过表达抗逆功能基因和动态调控等理性方法得到抗逆菌株，目前，已报道的抗逆功能基因主要包括调控细胞壁和细胞膜、dna修复、氧化应激、能量产生和信号转导的相关基因以及外排泵、热激蛋白和全局转录因子等，如发明人应汉杰通过利用crispr-cas9技术敲除基因cln3后得到基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株增加了生物产量，缩短了发酵周期，通过过表达转录调控因子mig1基因，得到了耐受15％浓度乙醇的基因工程菌株。
4.新抗逆基因的发现和应用是改善菌株胁迫抗逆性，提高生产性能的有效手段，是本领域技术人员持续关注的热点之一。


技术实现要素：

5.本发明提供一种提高菌株抗逆性的方法以及通过该方法筛选得到的基因在提高菌株抗逆性中的应用，用于提高菌株的胁迫抗逆性。
6.本发明第一方面提供一种提高菌株抗逆性的方法，包括如下步骤：
7.将具备抗逆性的菌株和不具备抗逆性的菌株在胁迫条件下培养，培养结束后进行转录组测序，比较具备抗逆性的菌株和不具备抗逆性的菌株的转录组数据，按基因的转录水平进行排序，分析得到显著上调基因；
8.将所述显著上调基因转入目标菌株，得到能够表达所述显著上调基因的目标菌株。
9.本发明提供一种提高菌株抗逆性的方法，通过分析具备抗逆性的菌株和不具备抗逆性的菌株的转录组数据，挖掘相关抗逆基因，并通过基因工程手段转入目标菌株中，有助于提高目标菌株的抗胁迫能力，实现菌株在胁迫条件下的快速生长与代谢，并且所获得的
菌株遗传性能稳定，适合发酵产业工业化应用。
10.在一种具体实施方式中，图1为本发明一实施例提供的提高菌株抗逆性方法的流程图，如图1所示，具体包括如下步骤：
11.首先，将具备抗逆性的菌株和不具备抗逆性的菌株在胁迫条件下培养，培养结束后进行转录组测序；
12.在公开号为cn 111334442 a的中国专利提供的耐高温酿酒酵母的基础上，本发明选用该菌株作为具备抗逆性的菌株，具体地，所述具备抗逆性的菌株为酿酒酵母，所述酿酒酵母保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.16831；不具备抗逆性的菌株可以为常规工业酿酒酵母。
13.将上述两株菌在一定的胁迫条件下培养，所述胁迫条件为：将所述菌株在31-42℃下培养，所使用的培养基为常规培养基，且培养基中葡萄糖的浓度为2-200g/l。
14.培养一定时间后，对两株菌进行转录组测序，获取具备抗逆性的菌株和不具备抗逆性的菌株的转录组数据。
15.其次，比较具备抗逆性的菌株和不具备抗逆性的菌株的转录组数据，按基因的转录水平进行排序，分析得到显著上调基因；
16.通过对两株菌的转录组数据进行评估、筛选，分析得到显著上调基因，所述显著上调基因为fmp16、ykr075c、ddr2、coa2、uip4、mcr1、pai3、spg1、sip18中的一种或多种，其中：
17.基因fmp16具有seq id no:1所示的核苷酸序列；
18.基因ykr075c具有seq id no:2所示的核苷酸序列；
19.基因ddr2具有seq id no:3所示的核苷酸序列；
20.基因coa2具有seq id no:4所示的核苷酸序列；
21.基因uip4具有seq id no:5所示的核苷酸序列；
22.基因mcr1具有seq id no:6所示的核苷酸序列；
23.基因pai3具有seq id no:7所示的核苷酸序列；
24.基因spg1具有seq id no:8所示的核苷酸序列；
25.基因sip18具有seq id no:9所示的核苷酸序列。
26.最后，将所述显著上调基因转入目标菌株，得到能够表达所述显著上调基因的目标菌株；
27.本领域技术人员可根据上述显著上调基因，通过常规的基因工程手段，将显著上调基因转入目标菌株，得到能够表达所述显著上调基因的目标菌株。本发明以酿酒酵母和大肠杆菌为例，进行发酵验证；
28.在一种具体实施方式中，将所述显著上调基因转入目标菌株，得到能够表达所述显著上调基因的目标菌株，具体包括如下步骤：将所述显著上调基因与启动子、终止子组装得到表达盒，表达盒指能够在目标菌株中有效表达目的基因的dna序列，图2为本发明一实施例提供的表达盒构建示意图，如图2所示，表达盒包括启动目的基因转录的启动子(promoter)，目的基因(goi)、终止目的基因转录的终止子(terminator)和marker，marker用于检验目的基因是否成功构建到菌株的染色体中，随后，将组装成功的表达盒转化整合到目标菌株的染色体上，通过筛选阳性转化子，得到能够表达所述显著上调基因的目标菌株，所述目标菌株为酿酒酵母，所使用的启动子、终止子的序列可以根据显著上调基因进行
选择，所使用的材料和方法均为本领域常规技术手段，本发明在此不做过多赘述。
29.在另一种具体实施方式中，将所述显著上调基因转入目标菌株，得到能够表达所述显著上调基因的目标菌株，具体包括如下步骤：通过gibson组装或酶切将显著上调基因连接到表达质粒中得到重组载体，将所述重组载体转入目标菌株中，通过筛选得到能够表达所述显著上调基因的目标菌株，所述目标菌株为酿酒酵母或大肠杆菌。
30.菌株培养过程所使用的培养基及培养条件均可根据本领域常规技术手段进行设置，例如，培养基为ypd培养基或lb培养基，培养条件为摇床培养。
31.本发明第二方面提供一种基因在提高菌株抗逆性中的应用，所述基因为fmp16、ykr075c、ddr2、coa2、uip4、mcr1、pai3、spg1、sip18中的一种或多种，其中：
32.基因fmp16具有seq id no:1所示的核苷酸序列；
33.基因ykr075c具有seq id no:2所示的核苷酸序列；
34.基因ddr2具有seq id no:3所示的核苷酸序列；
35.基因coa2具有seq id no:4所示的核苷酸序列；
36.基因uip4具有seq id no:5所示的核苷酸序列；
37.基因mcr1具有seq id no:6所示的核苷酸序列；
38.基因pai3具有seq id no:7所示的核苷酸序列；
39.基因spg1具有seq id no:8所示的核苷酸序列；
40.基因sip18具有seq id no:9所示的核苷酸序列。
41.本发明第三方面提供一种能够表达上述基因的菌株。
42.在一种实施方式中，所述菌株为酿酒酵母或大肠杆菌。
43.本发明第四方面提供上述任一所述的菌株在工业生产中的应用。
44.本发明提供一种提高菌株抗逆性的方法，通过分析具备抗逆性的菌株和不具备抗逆性的菌株的转录组数据，挖掘相关抗逆基因，并通过基因工程手段转入目标菌株中，有助于提高目标菌株的抗胁迫能力，实现菌株在胁迫条件下的快速生长与代谢，并且所获得的菌株遗传性能稳定，适合发酵产业工业化应用。
附图说明
45.图1为本发明一实施例提供的提高菌株抗逆性方法的流程图；
46.图2为本发明一实施例提供的表达盒构建示意图。
具体实施方式
47.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
48.本发明以下实施例中所使用的具备抗逆性的酿酒酵母菌购买自中国菌株菌种保藏管理委员会普通菌株中心，该菌株的保藏编号为cgmcc no.16831；液体ypd培养基包括1％酵母粉、2％蛋白胨和葡萄糖(根据实际需要进行添加)；液体lb培养基包括1％氯化钠、0.5％酵母粉、1％蛋白胨。
49.实施例1
50.将常规工业酿酒酵母和具备抗逆性的酿酒酵母菌在高温高糖双重胁迫条件下(37℃，20g/l葡萄糖)培养24h后进行rna-seq测序分析。通过对比转录组数据，分析差异表达基因，挑选显著上调基因fmp16，fmp16是位于iv号染色体上的未知功能基因，其基因长度为282bp，碱基序列如seq id no:1所示。
51.以酵母基因组为模板pcr后通过dna琼脂糖凝胶电泳回收目的片段fmp16，通过gibson组装与pet28a表达质粒进行连接，得到重组载体，将重组载体转入大肠杆菌中，菌落pcr验证成功后测序，将测序结果正确的菌株发酵验证。通过液体lb培养基，在42℃下培养，培养4h后采用iptg诱导，发现与对照菌株相比，工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了73％。
52.实施例2
53.本实施例使用的显著上调基因与实施例1相同。
54.以酵母基因组为模板，利用上下游引物将fmp16和酵母内源的启动子sod1p和终止子cyc1t通过oepcr连接成表达盒，利用ho整合位点通过电转化转入酿酒酵母by4742中，在添加g418(遗传霉素)的固体ypd培养基中进行转化子筛选，菌落pcr验证得到阳性转化子后发酵验证。在31℃、葡萄糖浓度2g/l的液体ypd培养基中培养，定时取样。将培养的细胞进行生物量(od600)的测定，结果发现过表达fmp16工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了42％。
55.实施例3
56.将常规工业酿酒酵母和具备抗逆性的酿酒酵母菌在高温高糖双重胁迫条件下(34℃，100g/l葡萄糖)培养24h后进行rna-seq测序分析。通过对比转录组数据，分析差异表达基因，挑选显著上调基因ykr075c，ykr075c是位于xi号染色体上的未知功能基因，其基因长度为924bp，碱基序列如seq id no:2所示。
57.以酵母基因组为模板pcr后通过dna琼脂糖凝胶电泳回收目的片段ykr075c，通过gibson组装与pet28a表达质粒进行连接，得到重组载体，将重组载体转入大肠杆菌中，菌落pcr验证成功后测序，将测序结果正确的菌株发酵验证。通过液体lb培养基，在39℃下培养，培养4h后采用iptg诱导，发现与对照菌株相比，工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了36％。
58.实施例4
59.本实施例使用的显著上调基因与实施例3相同。
60.将ykr075c从酵母基因组上克隆，分别与tef1p和slm5t连接成表达盒，通过ypr3c整合位点整合到酿酒酵母by4741的染色体上，利用bleo(博来霉素)筛选得到阳性转化子后发酵验证。在32℃、葡萄糖浓度20g/l的lb液体培养基中培养。将培养的细胞进行生物量(od600)的测定，结果发现过表达ykr075c工程菌株的细胞生长量明显高于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了51％。
61.实施例5
62.将常规工业酿酒酵母和具备抗逆性的酿酒酵母菌在高温高糖双重胁迫条件下(37℃，20g/l葡萄糖)培养24h后进行rna-seq测序分析。通过对比转录组数据，分析差异表达基因，挑选显著上调基因ddr2，ddr2是位于xv号染色体上的与dna损伤响应可能有关的基因，
其基因长度为186bp，碱基序列如seq id no:3所示。
63.以酵母基因组为模板pcr后通过dna琼脂糖凝胶电泳回收目的片段ddr2，通过gibson组装与pet28a表达质粒进行连接，得到重组载体，将重组载体转入大肠杆菌中，菌落pcr验证成功后测序，将测序结果正确的菌株发酵验证。通过液体lb培养基，在45℃下培养，培养4h后采用iptg诱导，发现与对照菌株相比，工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了23％。
64.实施例6
65.本实施例使用的显著上调基因与实施例5相同。
66.将ddr2从酵母基因组上克隆，分别与fba1p和atp1t连接成表达盒，整合到酿酒酵母by4741的染色体上，通过g418(遗传霉素)筛选得到阳性转化子后发酵验证。在34℃、葡萄糖浓度60g/l的lb液体培养基中培养。将培养的细胞进行生物量(od600)的测定，过表达ddr2工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了54％。
67.实施例7
68.将常规工业酿酒酵母和具备抗逆性的酿酒酵母菌在高温高糖双重胁迫条件下(40℃，200g/l葡萄糖)培养24h后进行rna-seq测序分析。通过对比转录组数据，分析差异表达基因，挑选显著上调基因coa2，coa2是位于xvi号染色体上的与细胞色素氧化酶组装因子有关的功能基因，其基因长度为207bp，碱基序列如seq id no:4所示。
69.将coa2从酵母基因组上克隆，分别与gpd14p和tef1t连接成表达盒，整合到酿酒酵母by4742的染色体上，通过leu(亮氨酸)营养缺陷型筛选得到阳性转化子后发酵验证。在36℃、葡萄糖浓度100g/l的lb液体培养基中培养。将培养的细胞进行生物量(od600)的测定，过表达coa2工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了58％。
70.实施例8
71.将常规工业酿酒酵母和具备抗逆性的酿酒酵母菌在高温高糖双重胁迫条件下(39℃，200g/l葡萄糖)培养24h后进行rna-seq测序分析。通过对比转录组数据，分析差异表达基因，挑选显著上调基因uip4，uip4是位于xvi号染色体上的与泛素样蛋白有关的功能基因，其基因长度为915bp，碱基序列如seq id no:5所示。
72.将uip4从酵母基因组上克隆，分别与tef1p和sod1t连接成表达盒，整合到酿酒酵母by4742的染色体上，通过his(组氨酸)营养缺陷型筛选得到阳性转化子后发酵验证。在38℃、葡萄糖浓度140g/l的lb液体培养基中培养。将培养的细胞进行生物量(od600)的测定，过表达uip4工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了34％。
73.实施例9
74.本实施例使用的显著上调基因与实施例8相同。
75.以酵母基因组为模板pcr后通过dna琼脂糖凝胶电泳回收目的片段uip4，通过gibson组装与pet28a表达质粒进行连接，得到重组载体，将重组载体转入大肠杆菌中，菌落pcr验证成功后测序，将测序结果正确的菌株发酵验证。通过液体lb培养基，在37℃下培养，培养4h后采用iptg诱导，发现与对照菌株相比，工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，
工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了40％。
76.实施例10
77.将常规工业酿酒酵母和具备抗逆性的酿酒酵母菌在高温高糖双重胁迫条件下(37℃，200g/l葡萄糖)培养24h后进行rna-seq测序分析。通过对比转录组数据，分析差异表达基因，挑选显著上调基因mcr1，mcr1是位于xi号染色体上的与线粒体nadh细胞色素b5还原酶有关的功能基因，其基因长度为909bp，碱基序列如seq id no:6所示。
78.将mcr1从酵母基因组上克隆，分别与gap14p和cyc1t连接成表达盒，整合到酿酒酵母by4741的染色体上，通过g418(遗传霉素)筛选得到阳性转化子后发酵验证。在40℃、葡萄糖浓度160g/l的lb液体培养基中培养。将培养的细胞进行生物量(od600)的测定，过表达mcr1工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了57％。
79.实施例11
80.本实施例使用的显著上调基因与实施例10相同。
81.以酵母基因组为模板pcr后通过dna琼脂糖凝胶电泳回收目的片段mcr1，通过gibson组装与pet28a表达质粒进行连接，得到重组载体，将重组载体转入大肠杆菌中，菌落pcr验证成功后测序，将测序结果正确的菌株发酵验证。通过液体lb培养基，在41℃下培养，培养4h后采用iptg诱导，发现与对照菌株相比，工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了33％。
82.实施例12
83.将常规工业酿酒酵母和具备抗逆性的酿酒酵母菌在高温高糖双重胁迫条件下(37℃，200g/l葡萄糖)培养24h后进行rna-seq测序分析。通过对比转录组数据，分析差异表达基因，挑选显著上调基因pai3，pai3是位于xiii号染色体上的与细胞质蛋白酶a(pep4p)抑制剂有关的功能基因，其基因长度为207bp，碱基序列如seq id no:7所示。
84.将pai3从酵母基因组上克隆，分别与sod2p和tef1t连接成表达盒，整合到酿酒酵母by4742的染色体上，通过his(组氨酸)营养缺陷型筛选得到阳性转化子后发酵验证。在42℃、葡萄糖浓度200g/l的lb液体培养基中培养。将培养的细胞进行生物量(od600)的测定，过表达pai3工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了59％。
85.实施例13
86.本实施例使用的显著上调基因与实施例12相同。
87.以酵母基因组为模板pcr后通过dna琼脂糖凝胶电泳回收目的片段pai3，通过gibson组装与pet28a表达质粒进行连接，得到重组载体，将重组载体转入大肠杆菌中，菌落pcr验证成功后测序，将测序结果正确的菌株发酵验证。通过液体lb培养基，在38℃下培养，培养4h后采用iptg诱导，发现与对照菌株相比，工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了35％。
88.实施例14
89.将常规工业酿酒酵母和具备抗逆性的酿酒酵母菌在高温高糖双重胁迫条件下(39℃，200g/l葡萄糖)培养24h后进行rna-seq测序分析。通过对比转录组数据，分析差异表达基因，挑选显著上调基因spg1，spg1是位于vii号染色体上的与高温存活有关的功能基因，
其基因长度为288bp，碱基序列如seq id no:8所示。
90.将spg1从酵母基因组上克隆，分别与tef1p和sod1t连接成表达盒，整合到酿酒酵母by4741的染色体上，通过bleo(博来霉素)筛选得到阳性转化子后发酵验证。在38℃、葡萄糖浓度60g/l的lb液体培养基中培养。将培养的细胞进行生物量(od600)的测定，过表达spg1工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了52％。
91.实施例15
92.本实施例使用的显著上调基因与实施例14相同。
93.以酵母基因组为模板pcr后通过dna琼脂糖凝胶电泳回收目的片段spg1，通过gibson组装与pet28a表达质粒进行连接，得到重组载体，将重组载体转入大肠杆菌中，菌落pcr验证成功后测序，将测序结果正确的菌株发酵验证。通过液体lb培养基，在42℃下培养，培养4h后采用iptg诱导，发现与对照菌株相比，工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了13％。
94.实施例16
95.将常规工业酿酒酵母和具备抗逆性的酿酒酵母菌在高温高糖双重胁迫条件下(37℃，200g/l葡萄糖)培养24h后进行rna-seq测序分析。通过对比转录组数据，分析差异表达基因，挑选显著上调基因sip18，sip18是位于xiii号染色体上的渗透胁迫诱导有关的功能基因，其基因长度为240bp，碱基序列如seq id no:9所示。
96.将sip18从酵母基因组上克隆，分别与sod2p和sod1t连接成表达盒，整合到酿酒酵母by4742的染色体上，通过his(组氨酸)营养缺陷型筛选得到阳性转化子后发酵验证。在40℃、葡萄糖浓度60g/l的lb液体培养基中培养。将培养的细胞进行生物量(od600)的测定，过表达sip18工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了36％。
97.实施例17
98.本实施例使用的显著上调基因与实施例16相同。
99.以酵母基因组为模板pcr后通过dna琼脂糖凝胶电泳回收目的片段sip18，通过gibson组装与pet28a表达质粒进行连接，得到重组载体，将重组载体转入大肠杆菌中，菌落pcr验证成功后测序，将测序结果正确的菌株发酵验证。通过液体lb培养基，在40℃下培养，培养4h后采用iptg诱导，发现与对照菌株相比，工程菌株的细胞生长量明显优于对照菌株，工程菌株的鲁棒性与对照菌株相比提高了21％。
100.本发明提供了一种提高菌株抗逆性的方法，通过该方法筛选得到的显著上调基因具有提高微生物鲁棒性的功能，如fmp16可使大肠杆菌在42℃下的鲁棒性提高73％，使酿酒酵母在31℃下的细胞生长量提高42％，相比于利用胁迫驱动型启动子将tpo2p和tpo3p分别与乙酸抗逆基因acs2和胁迫调节转录因子基因haa1连接成表达盒在33℃下提高工业酵母细胞生长量8％，本发明所涉及的基因不仅能赋予酿酒酵母和大肠杆菌高温抗逆性，而且能大幅度提高工程菌株的鲁棒性。
101.本发明中过表达抗逆基因得到的基因工程菌株具有优良的耐高温性能，如过表达coa2的酿酒酵母工程菌株，其在36℃下细胞生长量与对照菌株相比提高了58％，远高于表达抗胁迫基因(过氧化物酶基因tsa2和过氧化氢酶基因ctt1)在35℃下的细胞生长量。本发
明所提供的抗逆基因有助于提高菌株的抗胁迫能力，加速菌株在胁迫条件下的生长与代谢，对发酵工业生产应用具有一定的促进作用。
102.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。