一种外泌体提取装置及提取方法与流程

1.本发明属于外泌体提取技术领域，具体涉及一种外泌体提取装置及提取方法。


背景技术：

2.外泌体(exosome)是由活细胞分泌的直径约为30-150nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中；外泌体携带有多种蛋白质、脂类、dna和rna等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物，具有很好的临床应用前景。
3.常见的外泌体提取方法是离心方法、亲和层析分离法、凝胶排阻方法、免疫磁珠法等，其中离心方法由于消耗的设备成本低，所以是最常见的方法。外泌体的离心提取方法包括密度梯度离心、超速离心、过滤离心等，利用细胞分泌物中不同物质的分子量不同的特点，在特定的离心转速下将外泌体离心并收集出来，然而离心的方法需要经过复杂的样品处理步骤，以及对外泌体的处理步骤，所以总体上耗时较长，因此，寻找一种快速简单的外泌体提取方法一直是本领域技术人员追求的目标。
4.yeasen外泌体快速抽提试剂盒是一种较快的外泌体提取试剂，其将收集的细胞上清液先经过3000g左右的离心，去除大的细胞碎片，然后收集上清并利用特殊的外泌体抽提试剂进行处理，然后再经过10000g左右的高速离心，使外泌体沉淀，最后利用pbs重悬，在12000g离心，收集含外泌体的上清。该试剂盒由于开发的特殊配方的抽提试剂，大大缩短的外泌体的总提取时间，提高了提取效率，该方法适用于血清、细胞培养液等样本中外泌体的提取，即适用范围广。该试剂盒仅仅是对提取试剂的改进，在进行离心操作时，采用的主要装置仍然为离心管以及与离心管配套使用的离心机，试剂盒使用方法要求“经过10000g左右的离心1h，然后吸走上清，收集外泌体沉淀”，然而外泌体的直径很小，不容易沉淀，所以仍然需要消耗较长的离心时间。
5.综上，所述需要开发一种可减少离心时间的提取装置，以配套yeasen外泌体快速抽提试剂盒，从而进一步提高外泌体的提取效率。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种外泌体提取装置及提取方法，所述装置可以配套yeasen外泌体快速抽提试剂盒的使用，实现了外泌体的快速提取，节约了时间消耗，也相应的节约了人力消耗，节能环保。
7.本发明的目的是提供一种外泌体提取装置，包括离心管和管盖，所述管盖盖合在所述离心管的管口处，还包括过滤组件，所述过滤组件包括多个过滤板、多个弹性套、转动连接部件和提杆，所述过滤板和多个所述弹性套用于截留外泌体，多个所述过滤板呈之字形排列，且相邻的所述过滤板之间或者相邻的所述弹性套之间通过转动连接部件连接，所述提杆的一端连接在位于最底层的所述过滤板上，另一端向上延伸并贯穿其余所有的所述
过滤板，且所述提杆可沿贯穿处上下活动，所述提杆的顶端还能贯穿所述管盖，并通过限位装置限位在所述管盖上。
8.优选的，上述外泌体提取装置，所述过滤板采用硬质材料制备；或者，所述过滤板采用软质材料制备，先用硬质环将所述过滤板的外周固定，然后在每个所述硬质环的外周对应套设有一个所述弹性套。
9.优选的，上述外泌体提取装置，所述转动连接部件为合页、转轴、铰链或者弹力带。
10.优选的，上述外泌体提取装置，所述限位装置为夹子结构或者固定套结构，所述固定套结构包括两个半圆形套，所述两个半圆形套的一端转动连接，另一端可拆卸连接，其中一个所述半圆形套固定在所述管盖顶部，所述提杆贯穿两个所述半圆形套之间，且两个所述半圆形套拼接并闭合后，能将所述提杆固定。
11.优选的，上述外泌体提取装置，所述提杆的位于顶部的所述过滤板上方的部分为可卷曲条。
12.优选的，上述外泌体提取装置，相邻的所述过滤板之间通过弹簧连接。
13.优选的，上述外泌体提取装置，每个所述过滤板上均开设有贯穿所述提杆的贯穿孔，相邻所述过滤板的所述贯穿孔之间通过柔性的防水套连接，相邻的所述防水套之间是连通的，所述提杆贯穿所有的所述防水套设置。
14.优选的，上述外泌体提取装置，还包括安装套，所述安装套套设在最顶层的所述过滤板的外部，所述安装套侧边安装在所述离心管管口处，所述管盖安装在所述安装套上。
15.优选的，上述外泌体提取装置，所述过滤板包括用于截留外泌体的底层过滤层和用于截留细胞碎片的顶层过滤层，所述顶层过滤层的边缘可拆卸插接在所述底层过滤层上，所述弹性套套设于所述顶层过滤层外部，并且套设在所述底层过滤层外周；相邻的所述底层过滤层与所述顶层过滤层之间通过所述转动连接部件连接，或者相邻的所述弹性套通过所述转动连接部件连接。
16.本发明还提供了一种外泌体提取方法，包括以下步骤：
17.第一步：采集样本，制备含有外泌体的上清液；
18.第二步：将所述上清液与外泌体提取试剂加入离心管中，混合均匀，然后将所述过滤组件放入所述离心管中，盖好所述管盖，打开所述限位装置，向下移动所述提杆，使所述过滤组件展开，然后利用所述限位装置固定好所述提杆，静置；
19.第三步：静置结束后，开启所述限位装置，将所述提杆向上移动，并使所述过滤组件压缩，离心；
20.第四步：离心结束后，将所述过滤组件移出所述离心管，然后回收所述过滤组件上的外泌体。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.1、本发明的离心管与离心机配套使用，过滤组件用于截留外泌体，其上的外泌体可以被pbs等试剂重悬，管盖盖合在离心管的管口处，用于阻止离心管内的液体流出。
23.2、本发明中，过滤组件的作用是在离心的时候截留外泌体，则外泌体可以沉淀在就近的过滤板上，无需沉淀至距离较远的离心管内底部，缩短外泌体的离心所需沉淀时间，节能环保。可设置好提取试剂的体积以及含有外泌体的上清液的体积，使得过滤组件展开时浸入溶液中，压缩时离开液面，则离心的时间和转速只需要满足能将过滤组件中的水沥
掉即可，可大大缩短离心时间。
24.3、本发明中，弹性套的一个作用是固定过滤板，防止其脱落，另一作用是与提杆等部件配合使用，对过滤板进行限位，防止过滤板在离心的过程中上下浮动；防水套的作用是防止外泌体从提杆与过滤板之间的间隙向下流动；安装套以及限位装置的作用是防止在离心过程中提杆与管盖脱离；弹簧的作用是维持过滤组件的展开结构；双层结构的过滤板的作用是对细胞碎片进行隔离，收集的大部分外泌体位于底层过滤层与顶层过滤层之间的空间，进一步节省了外泌体提取时间。
附图说明
25.图1为本发明实施例1的外泌体提取装置的结构透视图一；
26.图2为本发明实施例1的外泌体提取装置的结构透视图二；
27.图3为本发明实施例1的管盖与限位装置的连接结构俯视图；
28.图4为本发明实施例2的外泌体提取装置的立体结构图；
29.图5为本发明实施例3的过滤组件的立体结构图；
30.图6为本发明实施例4的相邻两个过滤板的连接示意图；
31.图7为本发明实施例4的相邻两个过滤板的连接结构的纵向切面图。
具体实施方式
32.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
33.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
34.术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征；在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
35.在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
36.在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一特征和第二特征直接接触，或第一特征和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于
第二特征。
37.实施例1
38.一种外泌体提取装置，参见图1-3，包括离心管1、过滤组件2和管盖3，离心管1与离心机配套使用，过滤组件2用于截留外泌体，其上的外泌体可以被pbs等试剂重悬，管盖3盖合在离心管1的管口处，用于阻止离心管1内的液体流出。
39.过滤组件2包括多个过滤板21、多个弹性套22、转动连接部件和提杆23，这些过滤板21的截留分子量小于外泌体的直径，比如，当采用多孔结构的过滤板21时，则过滤板21的滤孔直径小于30nm，也就是小于待提取的外泌体的直径，过滤板21的作用是在离心的时候截留外泌体，则外泌体可以就近沉淀，无需沉淀至距离较远的离心管1内底部，缩短外泌体的离心所需沉淀时间。过滤板21采用既不与提取试剂反应、又能进行过滤的材质，且其上截留的物料能够被快速溶出的材质制备，比如选择滤膜或者表面覆盖有滤膜的陶瓷滤板，过滤板21可以是硬质材料制备，也可以是软质材料制备。
40.弹性套22的一个作用是固定过滤板21，防止其脱落，另一作用是夹接在过滤板21与离心管1内壁之间，并与限位装置4、提杆23配合使用，对过滤板21进行限位，防止过滤板21在离心的过程中上下浮动，弹性套22也能够截留外泌体；当过滤板21采用的是硬质材料制备，则在每个过滤板21的外周对应套设有一个弹性套22，当过滤板21采用的是软质材料制备，则先用硬质环将过滤板21的外周固定，可制成类似团扇的结构，然后在每个硬质环的外周对应套设有一个弹性套22。弹性套22采用弹性材质制备，其表面可以设置成波浪形状，以增大摩擦力。
41.多个过滤板21呈之字形排列，且相邻的过滤板21之间或者相邻的弹性套22之间通过转动连接部件连接，转动连接部件为合页、转轴、铰链或者弹力带等可转动的结构，其目的是使之字形的结构可以伸长或者压缩，转动连接部件安装在过滤板21上或者安装在弹性套22上，优选的，与弹性套22配套的转动部件为弹力带。
42.提杆23的一端连接在位于最底层的一个过滤板21上，注意不管穿最底层的过滤板21，另一端向上延伸并贯穿其余所有的过滤板21，且提杆23可沿贯穿处上下活动，提杆23的顶端还能贯穿管盖3，并通过限位装置4限位在管盖3上。如果采用的是软质材料的过滤板21，则将提杆23底部通过粘接等方式固定在最底层的过滤板21上。限位装置4为夹子结构或者固定套结构，当为夹子结构时，夹子的夹臂端用于夹持提杆23，另一端安装在管盖3顶部；当采用固定套结构时，其结构参见图3，包括两个半圆形套41，两个半圆形套41的一端通过转轴等转动装置转动连接，两个半圆形套41的另一端通过锁扣连接，或者扣合连接，其中一个半圆形套41固定在管盖3顶部，提杆23贯穿两个半圆形套41之间的部分，两个半圆形套41拼接并闭合后，能将提杆23固定住，当两个半圆形套41打开后，提杆23可上下活动。注意，由于离心机通常是放置多个离心管结构的，所以限位装置4的尺寸不能太大，能够将提杆23固定即可。优选的，在过滤组件2呈伸展状态时，将提杆23的位于顶部过滤板21上方的部分采用可卷曲条制备，比如采用柔性条或者弹力条等材质制备，当离心时，将暴露在管盖3外部的部分缠绕在管盖3外壁，以节约空间。
43.需要说明的是，为了防止提取装置的部件与外泌体或者外泌体提取试剂反应，可在各部件的表面涂覆不与外泌体或者外泌体提取试剂反应的涂层，或者直接将各部件采用不与外泌体或者外泌体提取试剂反应的材质制备。
44.为了防止外泌体从提杆23与过滤板21之间的间隙向下流动，本实施例还设置了防水套211，每个过滤板21上均开设有贯穿提杆23的贯穿孔，相邻过滤板21的贯穿孔之间通过柔性的防水套211连接，且防水套211与贯穿孔边缘无缝连接，相邻的防水套211之间是连通的，提杆23贯穿所有的防水套211设置；该结构下，过滤板21最好采用硬质材质制备。
45.基于同一种发明构思，本实施例还提供了一种基于上述结构的外泌体的提取方法，包括以下步骤：
46.第一步：制备含有外泌体的上清液，比如参照yeasen的血清/血浆外泌体快速抽提试剂盒使用说明书中的步骤制备含有外泌体的上清液。
47.第二步：将上清液与外泌体提取试剂加入离心管1中，混合均匀，然后将过滤组件2放入离心管1中，盖好管盖3，打开限位装置4，向下移动提杆23，使过滤组件2展开成图1所示形状，然后利用限位装置4固定好提杆23，静置，比如在静置的过程中，参照yeasen的血清/血浆外泌体快速抽提试剂盒使用说明书中的试剂和步骤对含有外泌体的上清液进行处理。
48.第三步：静置结束后，开启限位装置4，将提杆23向上移动，并使过滤组件2压缩成图2所示形状，离心。
49.由于本实施例设置了特殊结构的过滤组件2，第二步静置过程中，外泌体可逐渐沉淀在过滤组件2的过滤板21上，并且离心过程中外泌体可沉淀在就近的过滤板21上，减少了外泌体的沉淀时间，最终可缩短离心时间，节能环保。弹性套22的形变作用使得过滤板21的上下移动变得可行，注意，不管过滤组件2是伸展状态还是压缩状态，弹性套22始终与离心管1内壁接触。
50.优选的，可设置好提取试剂的体积以及含有外泌体的上清液的体积，使得过滤组件2展开时浸入溶液中，压缩时离开液面，则离心的时间和转速只需要满足能将过滤组件2中的水沥掉即可，可大大缩短离心时间。
51.第四步：离心结束后，将过滤组件2移出离心管1，然后用pbs洗涤，回收过滤组件2上的外泌体，操作便捷。
52.必要时可采用旋转蒸发或者减压蒸发等方法进行浓缩，以提高外泌体的浓度，过滤组件2如果采用的是可回收的材质制备，则本发明的整个装置可以循环使用，节约资源。
53.对比实验：
54.参照yeasen的血清/血浆外泌体快速抽提试剂盒(41202es30/30ml规格)使用说明书的记载，分别利用普通离心管和实施例1的提取装置对血清样本中外泌体进行提取。
55.对照组外泌体分离的步骤如下：
56.1)样品处理：取血清样品至于离心管中，4℃，3000g离心10min，弃沉淀，上清在4℃，10000g离心20min，弃沉淀，获得含外泌体的上清液备用；
57.2)向上清液中加入4倍体积的1
×
pbs，混匀的混合液，再加入相当于混合液1/5体积的41202-a提取试剂，混匀，4℃静置2h，然后4℃，10000g离心60min，弃上清，收集含外泌体的沉淀；
58.3)最后用1
×
pbs重悬沉淀，本步骤使用的1
×
pbs的体积是初始血清样品体积的2/5；
59.4)重悬液再经过4℃，12000g离心2min，其沉淀，收集上清液，则该上清液中富含外泌体。bradford法测定本步骤上清中标志性蛋白cd63、cd9的含量，并换算成每毫升血清中
蛋白的含量，换算公式如下：
60.c
血
＝(c
上清
×v上清
)/v
血清
61.其中，c
血
，每毫升血清中蛋白的含量；c
上清
，4)中每毫升上清液中蛋白的含量；v
上清
，4)中上清液体积；v
血清
，血清样本体积。
62.重复测定三次，求取平均值，计算得到对照组的血清中cd63、cd9的含量分别为19.29
±
1.15μmg/ml血清、6593.29
±
924.23μmg/ml血清。
63.实验组外泌体分离的步骤与对照组的处理方法基本相同，区别如下：
64.2)中加入提取试剂并混匀后，将过滤组件2放入离心管1中，盖好管盖3，打开限位装置4，向下移动提杆23，使过滤组件2展开成图1所示形状，然后利用限位装置4固定好提杆23，4℃静置2h，10000g离心30min；
65.3)中先用一半体积1
×
pbs反复冲洗过滤组件2，然后再用另一半1
×
pbs继续反复冲洗过滤组件2，收集所有的冲洗液。计算得到实验组的血清中cd63、cd9的含量分别为19.46
±
0.99μmg/ml血清、6486.56
±
775.20μmg/ml血清；
66.与对照组相比，才用本实施例的提取装置后，步骤2)的离心时间缩短，但cd63、cd9的含量误差低于1.6％。
67.实施例2
68.一种外泌体提取装置，与实施例1的结构基本相同，区别在于：参见图4，为了使过滤组件2的结构稳定性更好，防止在离心过程中提杆23与管盖3脱离，本实施例还设置了用于固定过滤组件2的安装套5，过滤板21采用硬质材质制备，安装套5套设在最顶层的过滤板21的外部，且该最顶层的过滤板21外周不设置弹性套22，安装套5外周为筒装结构，其侧边能够螺接安装在离心管1管口处，管盖3安装螺接在安装套5外壁上。由于过滤板21是能够截流外泌体的，则在离心过程中，即使产生了管盖3漏液的情况，外泌体仍被截留在离心管1内部，仅仅是损失了外泌体提取试剂，不会造成外泌体损失。
69.利用本实施例的装置提取外泌体的方法参照实施例1，区别在于，多安装了安装套5。
70.实施例3
71.一种外泌体提取装置，与实施例1的结构基本相同，区别在于：参见图5，过滤板21采用硬质材质制备，并且相邻的过滤板21之间通过弹簧212连接，在弹簧212的自然伸展状态下，多个过滤板21呈展开状态分布，也就是对应了实施例1的“第二步”所用的结构，溶液将全部或者大部分过滤板21浸没，当向上提拉提杆23时，所有弹簧212均可压缩，并使多个过滤板21压缩，也就是对应了实施例1的“第三步”所用的结构。弹簧212可采用塑料弹簧，其不易生锈。
72.利用本实施例的装置提取外泌体的方法参照实施例1，区别在于，本实施例还利用弹簧212来维持过滤组件2的展开结构。
73.实施例4
74.一种外泌体提取装置，与实施例1的结构基本相同，区别在于：参见图6-7，过滤板21为双层结构，包括底层过滤层213和顶层过滤层214，顶层过滤层214为筒状结构，其底部为敞口，且可拆卸插接在底层过滤层213的靠近边缘位置设置的环形插槽上，为了提高插接稳定性，插槽上还设有提高摩擦力的环形垫，弹性套22位于顶层过滤层214外部，并且套设
在底层过滤层213外周，且弹性套22套设在底层过滤层213上后，弹性套22与顶层过滤层214接触，相邻的底层过滤层213与顶层过滤层214之间通过转动连接部件连接，或者相邻的弹性套22之间过所述转动连接部件连接。顶层过滤层214的滤孔直径小于细胞碎片的直径，且大于外泌体的直径，比如当细胞碎片的直径为1-3μm，则顶层过滤层214的滤孔直径小于1μm并大于150nm；裹底层过滤层213的滤孔直径小于外泌体的直径，比如小于30nm。
75.本发明的装置在进行静置和离心的过程中，可以对细胞碎片进行隔离，收集的大部分外泌体位于底层过滤层213与顶层过滤层214之间的空间，优选的，将弹性套22的顶部设置成与顶层过滤层214顶部边缘齐平，则只有很少的外泌体可能残留在小部分位于弹性套22上，则可省略到前期的除细胞碎片步骤，将顶层过滤层214拆卸掉，即可对底层过滤层213上截留的外泌体进行收集，进一步节省了外泌体提取时间。
76.优选的，为了适应过滤组件2的伸展与压缩形变，顶层过滤层214的不与底层过滤层213连接的部分可采用可形变的材质制备。
77.需要说明的是，本发明中未特别提及的部件连接关系均默认采用现有技术，由于其不涉及发明点，且为现有技术普遍应用，故不详述结构连接关系。
78.需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
79.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。