筛选用培养基及筛选方法

1.本发明涉及一种能够识别和筛选耳念珠菌(candida auris)的筛选用培养基及筛选方法。本技术根据2020年2月5日在日本提交的特愿2020-17999号要求优先权，并将其内容援引于此。


背景技术：

2.作为念珠菌病的病原菌被熟知的念珠菌存在超过400种，其中临床上重要的菌种达到20种。由于这些中的大多数在形态学及生化学上的性状近似，因此一般很难辨别。
3.有对识别念珠菌中已有的种类与其他种类的方法的研究。例如，专利文献1公开了在添加色素的亚低培养基中添加2,3,5-三苯基氯化四氮唑(ttc)和酵母提取物的念珠菌简易鉴别用培养基。该念珠菌简易鉴别用培养基是针对白色念珠菌(candida albicans)和格拉布勒他念珠菌(candida glabrata)，利用这些菌种在培养基上氧化还原能力的差异，通过菌落的色调来辨别两种念珠菌。
4.专利文献2公开了一种检测培养基中特定微生物菌株存在的方法，该方法中作为针对所述菌株的酶的底物，在培养基中添加至少一种色原体，以及高浓度的、选自碳水化合物的至少一种化合物，并在色原体水解后得到不同于发色团基本颜色的诱导后的颜色。该方法是针对包含白色念珠菌和热带念珠菌(candida tropicalis)的菌各自产生的酶，在培养基中添加作为该酶的底物的两种色原体，色原体水解后得到不同于发色团基本颜色的颜色，以将两者区分开来。现有技术文献专利文献
5.专利文献1日本特开平06-78793号公报专利文献2日本特表平09-500790号公报


技术实现要素：

发明所要解决的课题
6.即使在念珠菌中，本发明人发现并命名的耳念珠菌耐多药且致死率高，已成为全球威胁。即使在念珠菌中，该菌种也特别需要一种简便且迅速地调查是否存在于某个特定环境(例如，病房中等一定的封闭空间)的方法。
7.为了相对于例如念珠菌的其他菌种这样的其他菌识别出耳念珠菌，虽然可以通过例如分析菌的基因来进行识别，但这种分析需要设备，既不简便也需要时间和成本。
8.上述专利文献2等利用对酶底物的降解能力的检测技术中，可以在比较简便的设备、操作和较短的培养时间内进行检测，上述技术和应用该技术的检测方法可以检测出如白色念珠菌和热带念珠菌这样的其他念珠菌。然而，在上述技术中，并未发现将耳念珠菌与其他念珠菌进行区别的方法，该技术无法检测。
因此，目前还没有找到一种简便、快速地调查耳念珠菌存在的技术。
9.本发明是鉴于上述情况完成的，目的在于提供一种筛选用培养基和使用该培养基的筛选方法，其能够简便且快速地调查耳念珠菌的存在。用于解决课题的手段
10.为了解决上述课题，本发明具有以下方面。(1)一种筛选用培养基，所述筛选用培养基含有酶底物，并用于根据所述酶底物的降解能力的耳念珠菌筛选，其中所述酶底物包含棉子糖和木糖。(2)根据上述任一项所述的筛选用培养基，其中，所述耳念珠菌为耳念珠菌的东亚株，所述酶底物还包含n-乙酰氨基葡萄糖。(3)根据上述任一项所述的筛选用培养基，其中，所述耳念珠菌是耳念珠菌的东亚株，所述酶底物还包含葡萄糖酸钾。(4)根据上述任一项所述的筛选用培养基，其中，所述酶底物还包含甘油。(5)根据上述任一项所述的筛选用培养基，其中，所述酶底物还包含d-氨基葡萄糖盐酸盐。(6)根据上述任一项所述的筛选用培养基，其中，所述酶底物被标记为在被降解时分别显色为不同颜色。(7)一种筛选方法，所述筛选方法根据对酶底物的降解能力来对微生物进行筛选，当所述酶底物包含棉子糖，所述微生物对棉子糖的降解能力为阳性，所述酶底物包含木糖，所述微生物对木糖的降解能力为阴性时，判定所述微生物为耳念珠菌。(8)根据上述任一项所述的筛选方法，其中，当所述酶底物还包含n-乙酰氨基葡萄糖，所述微生物对n-乙酰氨基葡萄糖的降解能力为阴性时，判定所述微生物为耳念珠菌的东亚株。(9)根据上述任一项所述的筛选方法，其中，当所述酶底物还包含葡萄糖酸钾，所述微生物对葡萄糖酸钾的降解能力为阴性时，判定所述微生物为耳念珠菌的东亚株。(10)根据上述任一项所述的筛选方法，其中，当所述酶底物还包含甘油，所述微生物对甘油的降解能力为大于0％且20％以下的阴性时，判定所述微生物为耳念珠菌的东亚株。(11)根据上述任一项所述的筛选方法，其中，当所述酶底物还包含甘油，所述微生物对甘油的降解能力为阳性时，判定所述微生物为耳念珠菌的南美、非洲或南亚株。(12)根据上述任一项所述的筛选方法，其中，当所述酶底物为d-氨基葡萄糖盐酸盐，所述微生物对d-氨基葡萄糖盐酸盐的降解能力为阴性时，判定所述微生物为耳念珠菌的东亚株。(13)根据上述任一项所述的筛选方法，其中，当所述酶底物为d-氨基葡萄糖盐酸盐，所述微生物对d-氨基葡萄糖盐酸盐的降解能力为80％以上且小于100％的阳性时，判定所述微生物为耳念珠菌的南美株。(14)根据上述任一项所述的筛选方法，其中，当所述酶底物为d-氨基葡萄糖盐酸盐，所述微生物对d-氨基葡萄糖盐酸盐的降解能力为阳性时，判定所述微生物为耳念珠菌的非洲或南亚株。(15)根据上述任一项所述的筛选方法，其包括以下步骤：将样本接种到包含所述
酶底物的筛选用培养基中；在所述筛选用培养基中培养样本中所包含的微生物；以及检测所述筛选用培养基中的所述微生物。(16)根据上述任一项所述的筛选方法，其中，使用能够根据对每种酶底物不同颜色的显色来检测所述微生物对所述酶底物的降解能力的筛选用培养基。(17)根据上述任一项所述的筛选方法，其中，在培养所述微生物的步骤中，在35℃以上进行培养。发明效果
11.通过本发明，可以获得一种筛选用培养基和使用该培养基的筛选方法，其能够简便且快速地调查耳念珠菌的存在。
具体实施方式
12.下面，示出实施方式来说明本发明提供的筛选用培养基及筛选方法。但是，本发明不限于以下实施方式。
13.(筛选用培养基)(包含raf、xyl的培养基)本实施例的筛选用培养基含有酶底物，该筛选用培养基用于通过酶底物的降解能力筛选耳念珠菌，并且酶底物包含棉子糖和木糖。
14.所谓筛选是泛指甄别微生物的操作。泛指对包含筛选对象微生物的样本，针对一定微生物的存在或不存在，从有无这种可能性的阶段进行甄别的操作。筛选还指获得用于辨别样本中可能包含一定微生物的可能性的进一步信息(例如由多次筛选的结果辨别可能性)的阶段。筛选操作可以进行一次或多次，也可以多次进行同一筛选操作，也可以将这一系列操作统称为筛选。
15.本实施例的筛选用培养基用于筛选耳念珠菌(candida auris)。耳念珠菌中根据起源存在着分类为南美、非洲、东亚(日本及韩国)、南亚(印度)等支系(clade)的株(strain)。只要是耳念珠菌，本实施方式的筛选用培养基可以筛选属于任何支系的任何株。
16.本实施方式的筛选用培养基具体是通过某种微生物是否具有以特定化合物为底物进行降解的酶，即是否具有对特定酶底物的降解能力来筛选一定的菌的存在、不存在或菌的分类(某种微生物是否为该一定菌)。当微生物利用酶底物作为营养素时，降解能力也称为同化性。菌所降解的酶底物包括例如在本实施方式中使用的各种碳水化合物(糖)等。
17.作为这样的筛选用培养基，例如可以使用已知的酶底物培养基。酶底物培养基是针对目标微生物(菌种)特异性代谢(降解、同化)的底物，包含标记了色原体(发色物质)的酶底物的培养基。当目标菌种摄入酶底物并进行代谢时，色原体解离，缩合后的色原体发色(显色)，从而可以筛选出具有酶底物降解能力的菌种。作为对酶底物进行标记的色原体，例如可以使用通过水解释放能够产生偶联反应的两种不同发色团的化合物等。作为这样的化合物，例如可以使用吲哚基衍生物等。当培养基包含多种酶底物时，优选使用针对每种酶底物分别呈现不同颜色的色原体，例如使用不同化合物的色原体。
18.本实施方式的筛选用培养基含有酶底物中的棉子糖(raf)和木糖(xyl)。耳念珠菌显示出对棉子糖呈阳性，对木糖呈阴性的降解能力。具体而言，包括上述各支系在内的44株耳念珠菌的所有株，对棉子糖显示呈阳性(阳性率为100％)，对木糖显示呈阴性(阳性率为0％)。因此，当在本实施方式的筛选用培养基中培养的微生物显示出对棉子糖呈阳性，对木糖呈阴性的降解能力时，该微生物极有可能为耳念珠菌。此外，除耳念珠菌以外的其他主要病原菌中未发现对棉子糖呈阳性、对木糖呈阴性的降解能力的组合。因此，本实施方式的培养基可以用于筛选耳念珠菌。
19.当筛选用培养基为酶底物培养基时，优选在培养基中含有标记有色原体的棉子糖和木糖，其在降解时分别呈现不同的颜色。根据上述构成，在固体培养基上培养的微生物菌落中，可以筛选出呈现棉子糖降解时的颜色而不呈现木糖降解时的颜色的菌落为耳念珠菌，而仅呈现木糖降解时的颜色或同时呈现棉子糖和木糖降解时的颜色的菌落不是耳念珠菌。
20.(含其他底物的培养基)本实施方式的筛选用培养基中包含的酶底物在棉子糖和木糖之外，还可以包含其他酶底物。作为酶底物，可以适当选择用于识别现有菌种的酶底物。作为优选实例，筛选用培养基可含有n-乙酰氨基葡萄糖(nag)、葡萄糖酸钾(gnt)、甘油(gly)或d-氨基葡萄糖盐酸盐(gln)。筛选方法如下文所述，筛选用培养基在棉子糖和木糖之外，通过进一步含有这些酶底物，从而在除了微生物是否为耳念珠菌之外，可以获得其属于哪个支系的株的信息。
21.当筛选用培养基为上述酶底物培养基，并且包含棉子糖和木糖之外的其他酶底物时，优选进一步对其他酶底物进行标记，以显色为与棉子糖和木糖不同的颜色。根据该构成，根据显示棉子糖、木糖或其他酶底物(如n-乙酰氨基葡萄糖)降解能力的各自的显色可以获得培养的微生物是否是耳念珠菌以及属于哪个支系的株的信息。
22.(其他构成)当本实施方式的筛选用培养基为酶底物培养基时，则其他构成可以用于现有培养基的。例如，可以从成分已知的酶底物培养基的成分中适当地选择，例如发色培养基。酶底物培养基可以含有蛋白胨、酵母提取物、糖、矿物质和维生素等栄養素。作为栄養素，优选使用蛋白胨。酶底物培养基可以包含增稠剂或ph调节剂等。此外，还可以包含用于改善酶底物发色的添加剂，例如氧化还原试剂等。酶底物培养基可以包含抗菌剂，用于抑制筛选目标的微生物以外的繁殖。抗菌剂包括氨基糖苷类抗生素、如氯霉素或四环素等广谱抗生素、或头孢菌素或青霉素等。用于筛选耳念珠菌的抗生素优选使用氯霉素。酶底物培养基可酌情采用如液体、半流动或固体等现有形式，但当采用例如固体培养基，特别是平板固体培养基(板状)时，更容易培养和检测。为了形成固体培养基，可以使用如琼脂、卡拉胶或土方胶等传统使用的固化剂，在本实施方式中使用琼脂。
23.再者，除了一种培养基包含所有酶底物的情况外，筛选用培养基包含多种酶底物也可以是包含多种酶底物中的一种以上的多种培养基的组合。本实施方式还包括以下形态：例如，在预先单独分离出一种微生物并且样本仅包含该微生物的情况下，获得关于该微生物是否为耳念珠菌以及该微生物的其他的支系等信息时，分别在含有不同酶底物的不同的培养基中对样本进行培养，并获得对于每种酶底物的降解能力的信息。
24.(筛选方法)(通过包含raf、xyl的培养基筛选耳念珠菌)本实施方式的筛选方法是根据对酶底物的降解能力筛选微生物的筛选方法，当所述酶底物包含棉子糖，所述微生物对棉子糖的降解能力为阳性，所述酶底物包含木糖，所述微生物对木糖的降解能力为阴性时，判定所述微生物为耳念珠菌。具体地，通过使用上述筛选用培养基培养目标微生物并进行筛选。
25.本实施方式的筛选方法可以是对包含多种微生物的样本进行筛选以判定该样本中是否包含耳念珠菌，也可以是对某一种微生物进行筛选以判定其是否很可能为耳念珠菌。作为包含多种微生物的样本，可以考虑从可能存在微生物的特定空间采集的样本。
26.进一步具体地，本实施方式的筛选方法包括以下步骤：将样本接种到包含酶底物的筛选用培养基；在筛选用培养基中培养样本中所包含的微生物；以及检测筛选用培养基中的所述微生物。
27.例如，对使用上述酶底物培养基对包含多种微生物的样本中是否含有耳念珠菌进行筛选的方法进行说明。首先，进行将样本接种到包含酶底物的筛选用培养基的步骤。接种可以根据现有细胞培养方法酌情进行。
28.接下来，进行培养所述样本中所包含的微生物的步骤。具体地，通过在接种样本的酶底物培养基中培养微生物，使微生物在酶底物培养基上形成菌落。培养酶底物培养基的条件可以从现有已知的微生物培养条件中适当选择。在本实施方式中，优选在35℃以上进行培养。通过在35℃以上培养，可以培养出在接近人的体温条件下生长的病原菌，可以除去在较低温度下不生长的微生物。此外，还优选在高于40℃且低于42℃进行培养。由于耳念珠菌即使在41℃下也可以生长，因此在此温度条件下培养可以除去直至40℃下生长其他微生物。
29.培养时间可以从现有已知的微生物培养条件中适当地选择，例如进行24小时以上，优选48小时以上的培养。通过上述时间的培养，可以充分地形成菌落，达到能够确认显色的程度。
30.接下来，进行检测筛选用培养基中的所述微生物的步骤。在本实施方式中，通过确认在所述酶底物培养基中形成的微生物菌落的显色，筛选出菌落中的微生物是否为耳念珠菌。显色的确认，对于每个微生物菌落，目测酶底物上标记的发色体的颜色是否显色即可。在上述酶底物培养基中，使用能够根据对每种酶底物不同颜色的显色来检测微生物对酶底物的降解能力的筛选用培养基。也就是说，在本实施方式的酶底物培养基中，对酶底物的棉子糖和木糖进行标记，以使得在被降解时分别显色为不同颜色。如前所述，耳念珠菌显示对棉子糖的降解能力，而不显示对木糖的降解能力。因此，在所述培养基中培养的微生物的菌落中，呈现出棉子糖降解时所显色的颜色，而不呈现出木糖降解时所显色的颜色的微生物的菌落可以判断为耳念珠菌。对于包含多种微生物的样本，当被接种到酶底物培养基上时，如果所培养的菌落中包含该显色的菌落，则可以判断该样本中含有耳念珠菌。
31.(用包含其他底物的培养基筛选菌支系)
当本实施方式的筛选用培养基进一步包含氨基葡萄糖(nag)时，耳念珠菌中东亚支系的株对n-乙酰氨基葡萄糖显示为阴性，而南美、非洲和南亚支系的株显示为阳性。因此，使用该培养基可以筛选出耳念珠菌东亚支系的株。
32.已知在耳念珠菌的支系中，与东亚支系相比，其他支系的病原性更高。在东亚的支系中，基本上只局限于内耳及外耳的局部感染，因此认为不一定会产生致命性感染。也就是说，通过筛选一种微生物是否是耳念珠菌以及是否属于东亚的支系，可以获得关于该微生物或包含该微生物的样本以及采集样本的环境的危险性的信息。
33.此外，当本实施方式的筛选用培养基中包含葡萄糖酸钾(gnt)时，耳念珠菌中东亚支系的株对n-乙酰氨基葡萄糖显示为阴性，而南美、非洲和南亚支系的株显示为阳性。因此，通过使用该培养基可以获得用于筛选耳念珠菌东亚支系的株的信息。
34.此外，当本实施方式的筛选用培养基中包含甘油(gly)时，耳念珠菌中，东亚支系的株中只有一部分(大约为大于0％且小于20％)对甘油显示为阳性，而南美、非洲和南亚支系的株显示为阳性。因此，通过使用该培养基可以获得用于对耳念珠菌东亚支系的株与其他株进行筛选的信息。
35.此外，当本实施方式的筛选用培养基中包含d-氨基葡萄糖盐酸盐(gln)时，耳念珠菌中东亚支系的株对d-氨基葡萄糖盐酸盐显示为阴性，非洲、南亚支系的株显示为阳性，南美支系的株之中的大多数(大约为大于80％且小于100％)显示为阳性。因此，通过使用该培养基可以获得用于对耳念珠菌东亚支系的株与其他株进行筛选的信息。
36.当筛选用培养基为上述酶底物培养基，并且含有与棉子糖和木糖不同的其他酶底物，进一步其他酶底物被标记为与棉子糖和木糖显色为不同颜色时，则可以根据表示棉子糖、木糖和其他酶底物(如n-乙酰氨基葡萄糖)降解能力的各自的显色，在筛选所培养的微生物是否为耳念珠菌的同时筛选是否为东亚支系。
37.这种根据显色的筛选也可以适当组合两个以上的底物以及各自不同的显色。例如，当筛选对象对2个以上的底物呈阳性时，就会显示2个以上的显色，微生物的菌落会显示它们混色的颜色，因此也可以根据菌落的色彩和深浅来得到对哪一个底物发生反应，即耳念珠菌中包含哪一个支系的株的信息。
38.(本实施方式的效果)本实施方式的筛选用培养基及筛选方法可以简便快速地筛选出耳念珠菌的存在。具体地，对于含有多种微生物的样本，例如从特定空间采集的样本，只需对平板固体培养基接种样本并培养的简便操作，以及24-48小时左右的短时间内就可以筛选出耳念珠菌的存在。接种和培养只要有能培养平板固体培养基的设备即可，微生物筛选也只需目测显色而不需要特殊设备和仪器。与基因分析等相比，平板固体培养基的筛选成本非常低。
39.(本实施方式的应用例)作为在本实施方式中进行筛选的样本，例如可以是从室内或室外的特定空间采集的样本。作为特定空间可以举出应当检测耳念珠菌的所有场所，例如可以举出医院内的各个房间，特别是手术室或者病房等。此外，也可以用在各机构、有高龄者或病患人员的福利机构等。如果在机场、海关等进行检测，可以用于所谓的出入境检疫措施。
40.本实施方式的筛选培养基及方法可以用于组合多次筛选的操作，以获得关于耳念珠菌或任何支系的菌的存在或不存在的信息。
此外，本实施方式的筛选培养基及方法可以与其他手段结合使用。例如，本实施方式的筛选培养基及方法可以用作前期筛选，以缩小要进行更详细基因分析的对象。本实施方式的筛选方法可以简便快速地进行，因此在作为筛选对象的样本(调查其存在的特定空间)和支系数量等较多的情况下特别有效。
41.(其他实施方式)本实施方式的筛选方法还可以用于针对一种微生物筛选该菌是否是耳念珠菌。在这种情况下，也可以使用包含上述棉子糖和木糖、或包含其他酶底物的酶底物培养基进行筛选。此外，本实施方式还包括在分别包含不同酶底物的不同培养基中培养以获得对于每种酶底物的降解能力的信息的形态。
42.对于酶底物培养基，虽然板状培养基更容易直接培养微生物，但也可以是其他形式。例如，培养基也可以较薄地形成薄膜状。由于将薄膜状培养基简单地设置在各种地方，直接进行培养并筛选也并不困难，因此可以设置在上述应当检测耳念珠菌的特定空间。实施例
43.以下示出实施例。需注意，本发明不限于以下实施例。
44.(耳念珠菌特异性酶底物的验证)对包括耳念珠菌在内的多种菌株，研究了各酶底物的降解能力。作为耳念珠菌，使用了表1所示的44株(作为支系，属于南美的菌种为10株，非洲为10株，东亚为10株，南亚为14株)。其他菌株是从日本国内具有代表性的病原酵母菌株中进行选择的。所使用的菌株在表2中显示为除耳念珠菌(candida auris)以外的株。
45.酶底物中，对于棉子糖(raf)、木糖(xyl)、n-乙酰氨基葡萄糖(nag)、葡萄糖酸钾(gnt)、甘油(gly)和d-氨基葡萄糖盐酸盐(gln)的各种酶底物，使用培养识别
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真菌试剂盒id32c api(sysmex biomerieux(株))的板作为能够将降解能力作为阳性率进行识别的试剂盒。将表1、表2的各株的菌液按照方案用悬浮介质(液体培养基)进行调整，提取到id32c api的板的各酶底物的阳性率检测杯中，培养48小时。培养后，通过目视判定，将与对照相同的透明的孔判断为阴性(-)，将相比于对照更不透明的孔判断为阳性( )，并使用id32c api附属的数据库软件4.0对阳性数据进行分析。
46.表1
表2
47.如表1所示，耳念珠菌的4个支系44株全部为raf降解能力为阳性，xyl降解能力为阴性。在表2中，耳念珠菌(表的最下行)显示所有44株的raf降解能力为阳性(100％)，xyl降解能力为阴性(0％)。另一方面，如表2的其他行所示，除耳念珠菌以外的病原菌株中，没有发现raf降解能力为100％阳性且xyl降解能力为阴性(阳性为0％)的组合。也就是说，在主要病原菌株中，只有耳念珠菌的raf降解能力为100％阳性，xyl降解能力为100％阴性。这表明，通过检测raf降解能力和xyl降解能力，可以筛选出耳念珠菌的存在或不存在。
48.在耳念珠菌的44株中，如表1所示，东亚株除了raf阳性和xyl阴性的结果外，nag为100％阴性。也就是说，这表明除了raf和xyl之外，还可以通过检测nag的降解能力来筛选该耳念珠菌是东亚株还是其他株。
49.此外，如表1所示，东亚株的gnt为0％阳性，而东亚以外的株为100％阳性。东亚支系显示gly呈10％阳性(即东亚的10株中只有1株显示为阳性)。由此可以认为，属于东亚支系的株中，包含大约在0-20％范围内对gly显示为阳性的株。另一方面，除东
亚以外的株为100％阳性。东亚支系中gln为0％阳性，与此相对，非洲、南亚为100％阳性，南美为90％阳性。由此可以认为，属于南亚支系的株中，包含大约在80-100％范围内对gly显示为阳性的株。也即，可以认为，可以将gly阳性率低的株、gln阴性的株作为东亚支系的株与其他株区别开来，并可以通过这些组合用于各株的筛选判断。工业实用性
50.通过本发明，可以获得一种筛选用培养基和使用该培养基的筛选方法，其能够简便且快速地调查耳念珠菌的存在。