免疫状态评估方法和试剂盒与流程

1.本发明属于免疫细胞领域，具体涉及一种与衰老密切相关的新型breg细胞亚群指标，以及基于该指标建立的一种可以评估个体免疫年龄的生物信息分析模型。


背景技术：

2.人体的免疫系统功能会随着年龄增长而逐渐衰退，老年人相较于年轻人更容易受到病原体入侵而引发感染，患各类慢性病及癌症的风险也逐年升高。这种免疫系统的衰退具体可体现在免疫细胞种群数量、功能和多样性的下降，而且伴随着免疫平衡失调，炎症因子水平升高等现象。2020年，新型冠状病毒疫情引起了人们对于免疫力的重视，在流行病传播过程中，医疗机构人员发现：不同个体对新型病原体的免疫能力差异较大，一些免疫力较强的人群能够很快获得康复，而一些免疫力低下的人群却可能危及生命。为了合理分配医疗资源，个性化定制诊疗方案，一种能够量化人体免疫功能水平的免疫年龄模型将会有广大应用前景。
3.目前，流式细胞术被广泛应用于临床和科研，该技术可以较为精确地量化常见免疫细胞亚群的数量和分布比例。通过流式细胞仪检测出不同免疫细胞亚群的数量比例，并利用生物信息手段建立分析模型，可基本预测出个体的免疫年龄，从细胞水平评估其免疫衰老程度。但现有的免疫年龄模型，所使用的指标大部分都属于t细胞亚群，而另一类重要的免疫细胞——b细胞亚群则很少被纳入模型，主要是由于常见的b细胞亚群与年龄的相关性较小，导致现有模型无法全面评估人体免疫细胞的衰老情况。本领域尚未发现与年龄的相关性大的b细胞亚群。


技术实现要素：

4.本发明发现了一种与年龄相关性较高的新型b细胞亚群(breg)，该细胞与年龄有更好的相关性，能反映出b细胞的免疫衰老水平。基于所发现的新型breg细胞亚群，发明人建立了一种更全面地反映t细胞和b细胞整体的免疫衰老水平的免疫年龄评估算法。
5.本发明第一方面提供调节性b细胞和/或其检测试剂在预测免疫状态或制备用于检测所述调节性b细胞以预测免疫状态的试剂盒中的用途。
6.在一个或多个实施方案中，所述免疫状态包括免疫能力、免疫衰老水平和免疫年龄。
7.在一个或多个实施方案中，免疫能力包括免疫系统产生免疫反应的能力或潜能。
8.在一个或多个实施方案中，免疫衰老水平是t细胞和b细胞的免疫衰老水平。
9.在一个或多个实施方案中，调节性b细胞(breg细胞)选自b细胞亚群cd19 cd38 cd27 cd24 和b10细胞亚群中的一种或多种。
10.在一个或多个实施方案中，所述预测免疫状态包括：通过调节性b细胞在对象样品中的细胞数量水平和参考范围对比，评估对象的免疫状态。所述参考范围是健康人参考范围或健康对照的细胞数量水平。
11.在一个或多个实施方案中，所述预测免疫状态包括通过建立数学模型预测免疫年龄；数学模型例如选自随机森林、逻辑回归、灰色预测、bp神经网络、支持向量机中的一种或多种。
12.在一个或多个实施方案中，所述免疫年龄通过式(iii)校正：
13.adj i0＝i0 (t
0-i0)*alpha
ꢀꢀ
(iii)
14.其中，adj i0：免疫年龄校正值；t0：实际年龄；i0：免疫年龄预测值；alpha：0-1。优选地，alpha＝0.4-0.6。更优选地，alpha＝0.6。
15.在一个或多个实施方案中，所述细胞水平是样品(例如血源样品)中的细胞水平；血源样品例如血浆、血清、血液。优选地，所述样品是外周血液，或从外周血中分离和任选经体外培养的免疫细胞群。
16.在一个或多个实施方案中，所述细胞水平是细胞在样品中的占比。
17.在一个或多个实施方案中，所述细胞水平是通过robust统计方法计算的细胞在样品中的占比。
18.在一个或多个实施方案中，细胞水平通过流式细胞术检测。
19.在一个或多个实施方案中，所述检测试剂包括针对调节性b细胞的结合分子。
20.在一个或多个实施方案中，所述检测试剂包括针对以下一种或多种细胞表面蛋白的结合分子：cd19、cd38、cd27、和cd24。
21.在一个或多个实施方案中，结合分子是与相应物质产生抗原抗体反应的结合分子，例如抗体或含抗体的偶联物。
22.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含检测选自以下的一种或多种或全部细胞的细胞水平的试剂：cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞、cm th细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive b细胞、treg细胞。优选地，所述试剂包括与相应细胞产生抗原抗体反应的结合分子，例如抗体或含抗体的偶联物。优选地，所述抗体能与相应细胞表面的抗原结合。
23.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含检测以下细胞的细胞水平的试剂：
24.cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞，和/或
25.cd4/cd8细胞、cm th细胞、em tc细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive tc细胞、naive b细胞、treg细胞。
26.本发明第二方面提供一种用于确定对象免疫状态的试剂盒，包括，
27.(1)用于检测样品中调节性b细胞的细胞水平的检测试剂；
28.(2)用于检测样品中选自以下的一种或多种或全部细胞的细胞水平的检测试剂：cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞、cm th细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive b细胞、treg细胞；和
29.(3)任选的使用说明书。
30.在一个或多个实施方案中，调节性b细胞(breg细胞)选自b细胞亚群cd19 cd38 cd27 cd24 和b10细胞亚群中的一种或多种。
31.在一个或多个实施方案中，细胞水平是样品例如血源样品中的细胞水平；血源样品例如血浆、血清、血液。优选地，所述样品是外周血液，或从外周血中分离和任选经体外培
养的免疫细胞群。
32.在一个或多个实施方案中，细胞水平通过流式细胞术检测。
33.在一个或多个实施方案中，所述使用说明书中记载了本发明第三方面所述的方法。
34.在一个或多个实施方案中，(1)所述检测试剂包括针对调节性b细胞的结合分子。优选地，所述检测试剂是针对以下一种或多种物质的结合分子：cd19、cd38、cd27、和cd24。更优选地，结合分子是与相应物质产生抗原抗体反应的结合分子，例如抗体或含抗体的偶联物。
35.在一个或多个实施方案中，(2)所述检测试剂是与相应细胞产生抗原抗体反应的结合分子，例如抗体或含抗体的偶联物。优选地，所述抗体能与相应细胞表面的抗原结合。
36.在一个或多个实施方案中，(2)所述检测试剂是检测以下细胞的细胞水平的试剂：
37.cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞，和/或
38.cd4/cd8细胞、cm th细胞、em tc细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive tc细胞、naive b细胞、treg细胞。
39.本发明还提供一种构建用于非诊断治疗目的的确定免疫状态的模型的方法，包括：
40.(1)获取样品，
41.(2)检测样品中调节性b细胞和选自以下的一种或多种或全部细胞的细胞水平：cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞、cm th细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive b细胞、treg细胞，
42.(3)通过数学方法利用所述细胞水平构建模型，
43.任选的(4)校正所述模型。
44.在一个或多个实施方案中，所述样品是来自多个对象的样品，例如获自至少100、200、300、400个对象的样品。
45.在一个或多个实施方案中，所述样品是血源样品，例如血浆、血清、血液。优选地，所述样品是外周血液，或从外周血中分离和任选经体外培养的免疫细胞群。
46.在一个或多个实施方案中，所述检测是流式细胞术检测。
47.在一个或多个实施方案中，所述细胞水平是细胞在样品中的占比，例如通过robust统计方法计算的细胞在样品中的占比。
48.在一个或多个实施方案中，所述模型是确定免疫年龄的模型，例如选自随机森林、逻辑回归、灰色预测、bp神经网络、支持向量机中的一种或多种。
49.在一个或多个实施方案中，步骤(4)通过式(iii)校正所述模型：
50.adj i0＝i0 (t
0-i0)*alpha
ꢀꢀ
(iii)
51.其中，adj i0：免疫年龄校正值；t0：实际年龄；i0：免疫年龄预测值；alpha：0-1。优选地，alpha＝0.4-0.6。更优选地，alpha＝0.6。
52.在一个或多个实施方案中，所述方法的其他特征如本发明第一方面中任一实施方案所述。
53.本发明第三方面提供一种用于非诊断治疗目的的确定对象免疫状态的方法，包
括：
54.(1)获取样品，
55.(2)检测样品中调节性b细胞和选自以下的一种或多种或全部细胞的细胞水平：cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞、cm th细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive b细胞、treg细胞，
56.(3)通过所述细胞水平与参考范围的对比，获得对象的免疫状态。
57.在一个或多个实施方案中，所述样品是血源样品，例如血浆、血清、血液。优选地，所述样品是外周血液，或从外周血中分离和任选经体外培养的免疫细胞群。
58.在一个或多个实施方案中，所述检测是流式细胞术检测。
59.在一个或多个实施方案中，所述细胞水平是细胞在样品中的占比，例如通过robust统计方法计算的细胞在样品中的占比。
60.在一个或多个实施方案中，所述参考范围是健康人参考范围或健康对照的细胞数量水平。
61.在一个或多个实施方案中，步骤(3)包括通过建立数学模型预测免疫年龄；数学模型例如选自随机森林、逻辑回归、灰色预测、bp神经网络、支持向量机中的一种或多种。
62.在一个或多个实施方案中，步骤(3)还包括任选的校正所述模型的步骤。
63.在一个或多个实施方案中，通过式(iii)校正所述模型：
64.adj i0＝i0 (t
0-i0)*alpha
ꢀꢀ
(iii)
65.其中，adj i0：免疫年龄校正值；t0：实际年龄；i0：免疫年龄预测值；alpha：0-1。优选地，alpha＝0.4-0.6。更优选地，alpha＝0.6。
66.在一个或多个实施方案中，所述方法的其他特征如本发明第一方面中任一实施方案所述。
67.本发明还提供一种用于确定对象免疫状态的介质，所述介质用于通过调节性b细胞和选自以下的一种或多种或全部细胞的细胞水平获取免疫状态：cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞、cm th细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive b细胞、treg细胞。
68.在一个或多个实施方案中，所述免疫状态是免疫年龄，其中细胞水平与免疫年龄的关系如式i和ii所示：
69.式i：女性免疫年龄＝284.035 1.077*cd4/cd8细胞水平 24.278*tcrα/βt细胞水平-262.777*em tc细胞水平-282.261*naive tc细胞水平-32.56*breg细胞水平 9.387*th2细胞水平-206.681*cm tc细胞水平，
70.式ii：男性免疫年龄＝69.689 1.883*cd4/cd8细胞水平 6.396*cm th细胞水平-21.079*em tc细胞水平-8.32*effector tc细胞水平-92.605*plasma blasts细胞水平-55.169*naive tc细胞水平 32.121*naive b细胞水平-32.514*breg细胞水平 76.598*treg细胞水平。
71.在一个或多个实施方案中，所述细胞水平是样品例如血源样品中的细胞水平；血源样品例如血浆、血清、血液。优选地，所述样品是外周血液，或从外周血中分离和任选经体外培养的免疫细胞群。
72.在一个或多个实施方案中，所述细胞水平是细胞在样品中的占比。
73.在一个或多个实施方案中，所述细胞水平是通过robust统计方法计算的细胞在样品中的占比。
74.在一个或多个实施方案中，细胞水平通过流式细胞术检测。
75.在一个或多个实施方案中，所述介质是一个或多个印刷品，如卡片、使用说明书。
76.在一个或多个实施方案中，所述一个或多个印刷品(例如以文字或图表的形式)提供所述的细胞水平与免疫年龄的关系。
77.在一个或多个实施方案中，所述介质是装置，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现本文第三方面任一实施方案所述的方法。
78.在一个或多个实施方案中，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：
79.(1)获取样品中调节性b细胞和选自以下的一种或多种或全部细胞的细胞水平：cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞、cm th细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive b细胞、treg细胞，
80.(2)通过所述细胞水平与参考范围的对比，获得对象的免疫状态。
81.在一个或多个实施方案中，所述样品是血源样品，例如血浆、血清、血液。优选地，所述样品是外周血液，或从外周血中分离和任选经体外培养的免疫细胞群。
82.在一个或多个实施方案中，所述检测是流式细胞术检测。
83.在一个或多个实施方案中，所述细胞水平是细胞在样品中的占比，例如通过robust统计方法计算的细胞在样品中的占比。
84.在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括通过建立数学模型预测免疫年龄；数学模型例如选自随机森林、逻辑回归、灰色预测、bp神经网络、支持向量机中的一种或多种。
85.在一个或多个实施方案中，步骤(2)还包括任选的校正所述模型的步骤。
86.在一个或多个实施方案中，通过式(iii)校正所述模型：
87.adj i0＝i0 (t
0-i0)*alpha
ꢀꢀ
(iii)
88.其中，adj i0：免疫年龄校正值；t0：实际年龄；i0：免疫年龄预测值；alpha：0-1。优选地，alpha＝0.4-0.6。更优选地，alpha＝0.6。
89.在一个或多个实施方案中，所述介质的其他特征如本发明第一方面中任一实施方案所述。
90.本发明的有益效果
91.1、本发明发现了一种与年龄有显著相关性的新型breg细胞亚群指标及其检测方法，相较于常见b细胞亚群指标，该新型指标能更准确地反映b细胞种群的免疫衰老水平。
92.2、本发明建立了一种免疫年龄预测模型，相较于现有基于免疫细胞种群数量构建的模型，该模型更全面地反映了t细胞和b细胞整体的免疫衰老水平，而不仅局限于t细胞亚群层面。并且，经过实际年龄校正后的免疫年龄，与个体实际年龄的差距可缩小到10岁以内，比现有技术背景下的其他免疫年龄模型更加精确。
附图说明
93.图1是四种b细胞亚群数量与年龄的相关性趋势图，其中breg细胞为本发明提出的新型breg细胞亚群指标。a，breg细胞；b，b细胞；c，memory b细胞；d，b细胞。
94.图2是基于新型breg细胞亚群建立的免疫年龄预测模型与实际年龄的相关性趋势图。a，女性；b，男性。
95.图3是去掉新型breg细胞亚群后，建立的免疫年龄预测模型与实际年龄的相关性趋势图。a，女性；b，男性。
96.图4是实施例1中流式细胞术定量检测细胞亚群的分析结果。
具体实施方式
97.在结合以下附图阅读本公开的实施例的详细描述之后，能够更好地理解本发明的上述特征和优点。
98.发明人发现一种与年龄相关性较高的新型b细胞亚群，其细胞表面标记物是cd19 cd38 cd27 cd24 ，属于尚未被充分研究过的一类调节性b细胞(bregs)，与b10细胞亚群接近。b10细胞具有免疫抑制功能，与白细胞介素10(il-10)介导的炎症反应相关，并且可反应一些自身免疫性疾病的活动状态，这与老年人体内较高的炎症水平和较弱的免疫功能水平相一致。因此，该细胞亚群可能是一种能反映个体免疫衰老的b细胞标记物。相较于常见的b细胞、memory b细胞和naive b细胞等标记物，新型breg细胞与年龄有更好的相关性，能反映出b细胞的免疫衰老水平。
99.基于此，发明人利用基于新型breg细胞亚群和其他与年龄相关性较强的t细胞亚群综合建模构建了免疫年龄评估方法。新型breg细胞亚群百分比相较常见的b细胞亚群百分比与年龄的相关性更强，能更好地反映b细胞衰老水平和免疫抑制功能。相较于现有的免疫年龄模型，本发明能更准确地反映t细胞和b细胞整体的免疫衰老水平，而不仅局限于t细胞层面。且经过计算公式优化，校正后的免疫年龄，与个体实际年龄的差距可缩小到10岁以内，比现有技术背景下的其他免疫年龄模型更加精确。
100.因此，本发明提供通过检测淋巴细胞的细胞水平来预测免疫状态的方法。所述淋巴细胞包括调节性b细胞(breg细胞)或选自以下的一种或多种或全部细胞：cd4/cd8细胞(辅助型t细胞与细胞毒性t细胞的比值)、tcrα/βt细胞(细胞表面标记物为tcrα/β蛋白的t细胞)、em tc细胞(效应记忆细胞毒性t细胞)、naive tc细胞(幼稚细胞毒性t细胞)、th2细胞(辅助型2类t细胞)、cm tc细胞(中央记忆细胞毒性t细胞)、cm th细胞(中央记忆辅助型t细胞)、effector tc细胞(效应细胞毒性t细胞)、plasma blasts细胞(浆母细胞)、naive b细胞(幼稚b细胞)、treg细胞(调节性t细胞)。本文所述“免疫状态”包括免疫能力、免疫衰老水平和免疫年龄。例如，免疫能力是免疫能力包括免疫系统产生免疫反应的能力或潜能。免疫衰老水平是t细胞和b细胞的免疫衰老水平。免疫年龄是反应免疫能力的年龄数值。
101.如上所述，调节性b细胞可以是b细胞亚群cd19 cd38 cd27 cd24 和/或b10细胞亚群。b细胞亚群cd19 cd38 cd27 cd24 是在细胞表面同时存在cd19、cd38、cd27、cd24四种标记物的b细胞。b10细胞亚群是在细胞表面同时存在cd19、cd38、cd24或cd19、cd1d、cd5标记物并且分泌il-10的细胞亚群。
102.本文所述的淋巴细胞(包括b和t细胞)可通过本领域已知的方法检测，例如流式细胞术、细胞计数法、血球计数仪等。通常，通过细胞表面的相应蛋白可以快速定性或定量检测细胞。例如，通过检测cd19、cd38、cd27、cd24四种标记物可定量检测b细胞亚群cd19 cd38 cd27 cd24 ；通过检测cd4和cd8可定量检测cd4/cd8细胞。可用于检测本文所述淋巴细胞
(包括b和t细胞)的表面蛋白本领域已知cd3、cd4、cd45ra、cd8、tcrγδ、tcrα/β、cd197(ccr7)、cd127、cd196(ccr6)、cd183、cd25、cd38、cd24、cd19、cd27、cd5、cd56。
103.可利用结合上述蛋白的结合分子来进行检测。常用的结合分子是与相应物质产生抗原抗体反应的结合分子，例如抗体或含抗体的偶联物。本文所述抗体包括但不限于：常规的具有两个重链和两个轻链的全抗体、单链抗体、重链抗体、或它们的抗原结合片段，例如fab、fab’、f(ab’)2、fv、vhh、微型抗体。抗体可以是单克隆抗体(包括全抗体，其具有免疫球蛋白fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体或单链分子。术语“重链抗体”是源自骆驼科生物或软骨鱼科生物的抗体。重链抗体的抗原结合片段包括vhh和单链重链抗体。术语“vhh”是重链抗体的可变区，即重链抗体的重链可变区结构域。本领域技术人员可以理解，结合分子并不局限于抗体，任何可与相应蛋白结合并被仪器检测到的分子均可用于本发明，例如亲和体、抗体偶联物、受体的靶结合区、细胞粘附分子、配体、酶、细胞因子、和趋化因子。
104.可检测来自对象的任何含有淋巴细胞的样品中的上述细胞水平用于评估免疫年龄，优选的样品是源自外周血的样品。
105.在检测了淋巴细胞的水平后，通过调节性b细胞在对象样品中的水平与参考范围的对比可获得对象的免疫状态。所述参考范围通常是健康人参考范围或健康对照的细胞数量水平。所述对比可通过构建数学模型实现。优选地，利用淋巴细胞水平通过建立数学模型来预测免疫年龄。本领域已知的数学模型均可用于本发明，例如随机森林、逻辑回归、灰色预测、bp神经网络、支持向量机。
106.在示例性实施方案中，细胞水平与免疫年龄的关系如式i和ii所示：式i：女性免疫年龄＝284.035 1.077*cd4/cd8细胞水平 24.278*tcrα/βt细胞水平-262.777*em tc细胞水平-282.261*naive tc细胞水平-32.56*breg细胞水平 9.387*th2细胞水平-206.681*cm tc细胞水平，式ii：男性免疫年龄＝69.689 1.883*cd4/cd8细胞水平 6.396*cm th细胞水平-21.079*em tc细胞水平-8.32*effector tc细胞水平-92.605*plasma blasts细胞水平-55.169*naive tc细胞水平 32.121*naive b细胞水平-32.514*breg细胞水平 76.598*treg细胞水平。
107.在知晓患者实际年龄的实施方案中，所述免疫年龄还可以经校正。在示例性实施方案中，校正公式如式(iii)所示为：
108.adj i0＝i0 (t
0-i0)*alpha
ꢀꢀ
(iii)
109.其中，adj i0：免疫年龄校正值；t0：实际年龄；i0：免疫年龄预测值；alpha：0-1。当alpha分别取0.4，0.5，0.6时，女性样本免疫年龄预测值和实际年龄的相关系数分别为0.8486，0.9041，0.9448；男性样本免疫年龄预测值和实际年龄的相关系数分别为0.915，0.9466，0.9692，同时确保免疫年龄校正值与实际年龄的差值的绝对值不超过15。在优选实施方案中，alpha＝0.4-0.6。更优选地，alpha＝0.6。
110.上述检测细胞的试剂可制成用于确定对象免疫状态的试剂盒，包括，(1)用于检测样品中调节性b细胞的细胞水平的检测试剂；(2)用于检测样品中选自以下的一种或多种或全部细胞的细胞水平的检测试剂：cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞、cm th细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive b细胞、treg细胞；和(3)任选的使用说明书(如本文所述的介质)。所述试剂盒还可包含所用检测方
法(例如流式细胞术)中所需的试剂，这些试剂本领域周知。
111.本发明还提供上述数学模型的构建方法，包括：(1)获取来自多个对象的样品，(2)检测样品中调节性b细胞和选自以下的一种或多种或全部细胞的细胞水平：cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞、cm th细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive b细胞、treg细胞，(3)通过数学方法利用所述细胞水平构建模型，任选的(4)校正所述模型。为了使模型精确，所述来自多个对象的样品可以是获自至少100、200、300、400个对象的样品。在获得了这些样品的细胞水平数据后，通过例如随机森林、逻辑回归、灰色预测、bp神经网络或支持向量机可以构建用于确定免疫年龄的模型。
112.本文所用示例性模型的构建包括指标筛选和回归建模。首先对数据进行quantile过滤，去除掉离群值，具体过滤方法为：四分位数间距(iqr，interquartile range)就是指上下四分位数之间的差值，即iqr＝q3-q1；对于检测值小于q1-1.5*iqr和大于q3 1.5*iqr的样本认为是离群点，保留检测值在(q1-1.5*iqr,q3 1.5*iqr)范围之内的样本。接着进行包含以下一步或两步的指标筛选，第一步根据皮尔森相关系数进行相关性分析，筛选出与年龄具有显著相关性的指标，相关性检验中取p value小于等于0.05的指标；第二步是根据统计学理论进行筛选，综合lasso，全子集回归，逐步回归三种算法的结果，进一步将指标数量缩小，找到建模的最优指标集。然后用多元线性回归的方法建立免疫年龄的预测模型。该模型还可通过常规校正方法校正，例如式(iii)。
113.此外，本发明还提供用于确定对象免疫状态的介质，所述介质用于通过调节性b细胞和选自以下的一种或多种或全部细胞的细胞水平获取免疫状态：cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞、cm th细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive b细胞、treg细胞。跟具体地，所述介质用于通过本文任一实施方案所述的方法确定免疫年龄。
114.所述介质可以是印刷品，如卡片、使用说明书，其上记载有本文所述的细胞水平与免疫年龄的关系，即式(i)-式(iii)中的一个或多个。
115.所述介质还可以包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序的装置，所述处理器执行所述程序时实现本文任一实施方案所述的方法。示例性地，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：(1)获取样品中调节性b细胞和选自以下的一种或多种或全部细胞的细胞水平：cd4/cd8细胞、tcrα/βt细胞、em tc细胞、naive tc细胞、th2细胞、cm tc细胞、cm th细胞、effector tc细胞、plasma blasts细胞、naive b细胞、treg细胞，(2)通过所述细胞水平与参考范围的对比，获得对象的免疫状态。其中，步骤(2)包括通过建立数学模型预测免疫年龄；数学模型例如选自随机森林、逻辑回归、灰色预测、bp神经网络、支持向量机中的一种或多种。步骤(2)还可包括任选的如上所述校正所述模型的步骤。
116.下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
117.实施例
118.实施例1，新型breg细胞亚群的检测方法(流式细胞术法)
119.本实施例展示如何利用流式细胞仪来筛选新型breg细胞亚群指标，并且对其进行
准确的定量计算，利用413例人群数据的robust统计，定义了该细胞亚群在健康人中的参考范围。
120.1.设备：navios流式细胞仪、eppendrof移液器、allegrax-12r流式贝克曼离心机、pic017台式微量离心机。
121.2.试剂耗材：axygen 1000ul枪头、axygen 200ul枪头、axygen 10ul枪头、beckman裂解液(溶血剂)、solarbio pbs磷酸盐缓冲液、falcon 5ml流式管、bd horizon
tm
bv510 mouse anti-human cd3、percp-cy
tm
5.5 mouse anti-human cd4、apc mouse anti-human cd45ra、apc-cy
tm
7 mouse anti-human cd8、fitc mouse anti-human tcrγδ、pe anti-human tcrα/β、brilliant violet 421
tm
anti-human cd197(ccr7)、fitc mouse anti-human cd127、pe mouse anti-human cd196(ccr6)、apc mouse anti-human cd183、brilliant violet 421
tm
anti-human cd25、bv421 mouse anti-human cd38、percp/cy5.5 anti-human cd24、fitc mouse anti-human cd19、brilliant violet 510
tm
anti-human cd27、apc anti-human cd5、pe/cy7 anti-human cd56(ncam)、1.5ml ep棕色避光管。
122.3.检测标本：检测标本为外周血，用edta采血管采集2-3ml，立刻颠倒混匀，当天内进行流式细胞检测。
123.4.操作步骤：
124.1)取4根流式管，分别加入100ul血样，记为管1、管2、管3、管4。
125.2)流式管中分别加入抗体，管1中加入panel1 28ul，管2中加入panel2 29ul，管3中加入panel3 27ul，管4中加入panel4 14ul。
126.panel1：cd3 2ul cd4 2ul cd8 2ul cd45ra 10ul tcrγδ2ul tcrα/β5ul cd197 5ul；
127.panel2：cd3 2ul cd4 2ul cd127 10ul cd196 5ul cd183 5ul cd25 5ul；
128.panel3：cd19 10ul cd38 5ul cd24 5ul cd27 5ul cd5 2ul；
129.panel4：cd3 2ul cd19 10ul cd56 2ul。
130.3)振荡混匀，避光孵育30分钟。
131.4)加入红细胞裂解液500ul，振荡混匀，避光孵育12分钟。
132.5)加入1ml pbs缓冲液，常温离心400g，5分钟。
133.6)弃上清后，加入1ml pbs缓冲液，常温离心400g，5分钟。
134.7)弃上清后，再加入300ul pbs缓冲液。
135.8)上机分析。
136.用专业流式细胞软件kaluza分析定量细胞亚群，细胞亚群分析如图4所示，breg即为本发明中发现的新型breg细胞亚群指标，该细胞亚群百分比的定量方法为breg细胞与b细胞的信号强度比，由软件自动计算得出。
137.以413例健康人样本的新型breg细胞亚群检测数据，应用robust统计方法计算该细胞亚群在健康人外周血中的参考范围为：0.02％-27.5％。robust统计方法参考“c28-a3医学实验室参考区间的定义和确定(defining,establishing,and verifying reference intervals in the clinical laboratory；approved guideline)”138.实施例2，相关性分析
139.收集健康人志愿者的外周血样本，男性189例，女性224例。根据年龄范围在30岁到
70岁之间筛选样本，剩下男性171例，女性205例。应用实施例1中的流式细胞检测方法，检测外周血样本中25种免疫细胞亚群，分别是：t细胞、b细胞、nk细胞、nkt细胞、th细胞、tc细胞、cd4/cd8、tcrα/βt细胞、tcrγ/δt细胞、cm th细、em th细胞、effector th细胞、cm tc细胞、em tc细胞、effector tc细胞、plasma blasts、memory b细胞、naive th细胞、naive tc细胞、naive b细胞、th1细胞、th2细胞、th17细胞、treg细胞、breg细胞。
140.对流式细胞仪定量分析出的25种免疫细胞亚群比例和志愿者年龄进行相关性检验(correlation test)；
141.按性别分类，分别计算男女健康人群中25种免疫指标与年龄的皮尔森相关系数(pearson's correlation coefficient)，计算公式为式(iv)：
[0142][0143]
选择其中四种b细胞亚群——b细胞、memory b、naive b细胞和breg细胞，对细胞亚群数量比例和年龄建立相关性趋势图，如图1所示。图1是四种b细胞亚群数量与年龄的相关性趋势图，其中，breg细胞为本发明提出的新型breg细胞亚群指标。
[0144]
表1和表2分别是健康女性人群和健康男性人群中25种细胞亚群与年龄的相关性系数表，根据实施例2的检测结果计算得出。
[0145]
表1，女性样本25项免疫检测指标与年龄相关性检测结果
[0146][0147]
[0148]
表2，男性样本25项免疫检测指标与年龄相关性检测结果
[0149][0150][0151]
实施例3，男女性免疫年龄预测模型
[0152]
以实施例1中定量检测的多种免疫细胞亚群比例作为指标，分别建立免疫年龄预测模型，建模过程如下所示。
[0153]
预测模型分为指标筛选和回归建模两个阶段；
[0154]
首先对数据进行quantile过滤，去除掉离群值，具体过滤方法为：四分位数间距(iqr，interquartile range)就是指上下四分位数之间的差值，即iqr＝q3-q1；对于检测值小于q1-1.5*iqr和大于q3 1.5*iqr的样本认为是离群点，保留检测值在(q1-1.5*iqr,q3 1.5*iqr)范围之内的样本。
[0155]
接着进行两步指标筛选，第一步如实施例2所述用式iv做相关性分析，筛选出与年龄具有显著相关性的指标，相关性检验中取p value小于等于0.05的指标；第二步是根据统计学理论进行筛选，综合lasso，全子集回归，逐步回归三种算法的结果，进一步将指标数量缩小，找到建模的最优指标集；接着用多元线性回归的方法建立免疫年龄的预测模型。
[0156]
女性免疫年龄预测模型计算公式如下：
[0157]
预测年龄＝284.035 1.077*cd4/cd8 24.278*tcrα/βt细胞-262.777*em tc细胞-282.261*naive tc细胞-32.56*breg细胞 9.387*th2细胞-206.681*cm tc细胞
[0158]
模型结果：
[0159][0160]
coefficients：系数；intercept：截距；estimate：估计值；std.error：标准误差；t value：t值；signif.codes：显著性标记；residual standard error：剩余标准误差；degrees of freedom：自由度；multiple r-squared：多重r平方；adjusted r-squared：调整后的r平方；f-statistic：f统计量；p-value：p值
[0161]
男性免疫年龄预测模型计算公式如下：
[0162]
male_immu_age＝69.689 1.883*cd4/cd8 6.396*cm th细胞-21.079*em tc细胞-8.32*effector tc细胞-92.605*plasma blasts细胞-55.169*naive tc细胞 32.121*naive b细胞-32.514*breg细胞 76.598*treg细胞
[0163]
模型结果：
[0164][0165]
模型评价采用预测模型的预测年龄与真实年龄之间的相关性系数值作为评价指标。图2是基于新型breg细胞亚群建立的免疫年龄预测模型与实际年龄的相关性趋势图。图中corr表示皮尔森相关系数，corr值越接近1说明预测年龄与真实年龄的相关性越好，模型
越精确。
[0166]
实施例4，利用实际年龄对预测年龄进行校正
[0167]
校正公式如下所示：
[0168]
adj i0＝i0 (t
0-i0)*alpha
[0169]
adj i0：免疫年龄校正值；t0：实际年龄；i0：免疫年龄预测值；alpha：系数，取值0～1之间；
[0170]
当alpha分别取0.4，0.5，0.6时，女性样本免疫年龄预测值和实际年龄的相关系数分别为0.8486，0.9041，0.9448；男性样本免疫年龄预测值和实际年龄的相关系数分别为0.915，0.9466，0.9692，同时确保免疫年龄校正值与实际年龄的差值的绝对值不超过15。
[0171]
最优地，校正后的预测年龄＝预测年龄 (实际年龄-预测年龄)*0.5
[0172]
实施例5，去掉breg细胞亚群前后免疫年龄预测模型的表现对比
[0173]
去掉breg后，女性模型的结果：
[0174][0175]
adjusted r-squared值从0.3536降低到0.3139；
[0176]
去掉breg细胞的女性免疫年龄模型的预测值与实际年龄的相关系数为0.4363；而包含breg细胞的女性免疫年龄模型的相关系数为0.5029。如图3所示。
[0177]
去掉breg后，男性模型的结果：
[0178][0179]
adjusted r-squared值从0.4374降低到0.4064；
[0180]
去掉breg细胞的男性免疫年龄模型的预测值与实际年龄的相关系数为0.5877；而包含breg细胞的男性免疫年龄模型的相关系数为0.622。如图3所示。
[0181]
上述结果说明，breg细胞亚群的纳入可以显著提高免疫年龄模型的预测精确度。