具有改进的反应性、稳定性以及抗体回收率的Z-结构域和隐钙素的融合蛋白以及使用其的用于分离和纯化抗体的方法与流程

具有改进的反应性、稳定性以及抗体回收率的z-结构域和隐钙素的融合蛋白以及使用其的用于分离和纯化抗体的方法
技术领域
1.本发明涉及具有改进的反应性、稳定性以及抗体回收率的z-结构域和隐钙素的融合蛋白，以及使用其的用于分离和纯化抗体的方法。具体地，本发明涉及一种编码具有改进的反应性、稳定性和抗体回收率的z-结构域和隐钙素的融合蛋白的核酸、包括所述核酸的重组表达载体、由所述重组表达载体转化的转基因生物、以及具有改进的反应性、稳定性以及抗体回收率和纯度的使用z-结构域和隐钙素的融合蛋白来分离和纯化抗体的方法。


背景技术：

2.单克隆抗体的纯化方法通常包括四个基本步骤。这些步骤包括：(1)收获-从发酵培养物中分离宿主细胞；(2)捕获-从经净化的收获物中的大部分成分中分离抗体；(3)微细净化-除去残留的宿主细胞污染物和聚集体；以及(4)制剂化-将抗体置于合适的载体中以获得最大的稳定性和存储期间的步骤。然而，这些步骤不一定会生产具有足以用于制药学环境的纯度的抗体组合物。因此，最重要的是生产和纯化适用于制药学且处于纯化形式的目标抗体，其中已经去除了杂质。
3.由于蛋白a色谱法(protein a chromatography)可以以单一步骤从细胞培养上清液中几乎完全纯化一般为igg的抗体，因此广泛用于工业抗体制备。然而，蛋白a色谱法具有由于重复使用导致色谱柱的配体必定在一定程度上泄漏的问题。此类蛋白a或蛋白a片段对igg具有亲和力，因此与抗体形成复合物来污染抗体，并且难以从纯化的抗体中去除。特别地，由于蛋白a是一种细菌蛋白，其可以诱导不期望的免疫反应，因此，需要从纯化的抗体中去除。因此，使用蛋白a色谱法的抗体纯化工艺具有必须在每个工艺中监测和去除蛋白a的残留量的问题。
4.对此，本发明人通过专利第10-1774354号(发明名称：使用z-结构域和隐钙素的融合蛋白的用于分离和纯化抗体方法)公开了一种无需使用通常用于抗体纯化的昂贵的蛋白a色谱法就能够以高纯度和高质量纯化抗体的方法。
5.先前的文献
6.1.韩国注册专利第10-1774353号


技术实现要素：

7.技术问题
8.本发明人在持续研究分离和纯化抗体的方法中，确认了通过改变在专利第10-1774353号中使用的由seq id no：1的氨基酸序列组成的z-结构域和由seq id no：4的氨基酸序列组成的隐钙素的氨基酸序列能够显着提高z-结构域和隐钙素的融合蛋白与钙的反应性、稳定性、抗体回收率和纯度，并完成本发明。
9.技术方案
10.本发明涉及一种编码具有改进的反应性、稳定性以及抗体回收率的z-结构域和隐
钙素的融合蛋白的核酸，其中，所述隐钙素由seq id no：5或seq id no：6的氨基酸序列组成。
11.本发明还涉及一种重组表达载体，其包括编码具有改进的反应性、稳定性以及抗体回收率的z-结构域和隐钙素的融合蛋白的核酸。
12.本发明还涉及一种由重组表达载体转化的转基因生物，所述重组表达载体包括编码具有改进的反应性、稳定性以及抗体回收率的z-结构域和隐钙素的融合蛋白的核酸。
13.本发明还涉及一种具有改进的反应性、稳定性和抗体回收率的用于分离和纯化抗体的方法，所述方法包括：
14.a)制备重组载体，其包括编码z-结构域和隐钙素的融合蛋白的核酸；
15.b)将所述重组载体转导至宿主细胞，从而获得转基因生物；
16.c)从所述转基因生物表达z-隐钙素蛋白；以及
17.d)使用钙从所表达的转基因生物分离结合有z-隐钙素蛋白的抗体，其中，所述隐钙素由seq id no：5或seq id no：6的氨基酸序列组成。
18.有益效果
19.相比于在现有注册专利第10-1774353号中公开的融合蛋白，根据本发明的z-结构域和隐钙素的融合蛋白更稳定，具有改进的根据钙的沉淀反应和抗体回收率，能够容易且快速地分离和纯化抗体，并与现有工业中广泛使用的蛋白a色谱法相比，能够以非常高的速度分离大量抗体，因此，可以减少纯化成本并防止抗体分解。此外，由于通过使用螯合物能够再使用z-结构域和隐钙素的融合蛋白，因此是经济实惠的。
20.附图简单说明
21.图1显示试验例1的zz-csq1(全部)和zz-csq2(δ)的根据钙浓度的浊度(turbidity)试验结果。
22.图2显示确认根据试验例1的zz-csq1(全部)和zz-csq2(δ)的稳定性的试验结果。
23.图3显示在将根据试验例1的zz-csq1(全部)的接头(linker)即g4s改变为4n、8n、le8n之后确认稳定性的试验结果。
24.图4显示测量根据试验例1的zz-csq1(全部)融合蛋白对抗体的亲和力的试验结果。
25.图5显示在抗体培养液中确认使用根据试验例1的zz-csq1(全部)融合蛋白纯化抗体的试验结果。
26.图6显示确认根据试验例1的zz-csq1(全部)对每个ph的抗体回收率(recovery)的试验结果。
27.图7显示在使用根据试验例1的zz-csq1(全部)融合蛋白纯化抗体后确认抗体的宿主细胞蛋白(hcp；host cell protein)的试验结果。
28.图8显示在使用根据试验例1的zz-csq1(全部)融合蛋白纯化抗体后确认抗体的宿主细胞dna(hcd；host cell dna)的试验结果。
29.图9显示在使用根据试验例1的zz-csq1(全部)融合蛋白纯化抗体后为了确认抗体或zz-csq1(全部)的聚集(aggregation)通过分子排阻高效液相色谱(sec-hplc)确认的试验结果。
30.图10显示在将根据试验例1的zz结构域改变为z6g和zl4g后测量抗体回收率的试
验结果。
31.图11显示试验例2的zz-csq2(全部)和zz-csq2(δ)的根据钙浓度的浊度试验结果。
32.图12显示确认根据试验例2的zz-csq2(全部)和zz-csq2(δ)的抗体回收程度的试验结果。
33.图13显示在将根据试验例2的zz-csq2(全部)的接头即g4s改变为4n、8n、le8n之后确认稳定性变化的试验结果。
34.图14显示确认通过使用根据试验例2的zz-csq2(全部)融合蛋白从抗体培养液中仅分离抗体的试验结果。
35.图15显示测量根据试验例3的z-csq1(全部)融合蛋白对抗体的亲和力的试验结果。
36.图16显示测量根据试验例4的(z)
5-csq1(全部)融合蛋白对抗体的亲和力的试验结果。
37.图17显示确认根据试验例5的(z)
5-csq1(全部)与抗体的结合比率的试验结果。
38.最佳模式
39.根据第一具体实施例，
40.本发明提供一种编码具有改进的反应性、稳定性以及抗体回收率的z-结构域和隐钙素的融合蛋白的核酸。
41.在本说明书中使用的术语“融合蛋白”是指通过结合(joining)两个或多个彼此独立地编码的基因而制备的蛋白。所述融合蛋白可以通过重组dna技术而人工制备。此外，所述融合蛋白可以是生理活性蛋白、或肽与免疫球蛋白fc片段在没有接头的情况下连接的形式、或肽与免疫球蛋白fc片段通过肽接头连接的形式。在此，肽接头是指将构成融合蛋白的两种蛋白相互连接的肽。可以包括所述肽接头，使得作为融合蛋白的组分的两种蛋白即使在融合蛋白的形式中也能够独立地折叠(folding)或维持其各自的功能，但不限于此。
42.在本说明书中使用的术语“免疫球蛋白fc片段”是指免疫球蛋白的重链和轻链可变区、除重链恒定区1(ch1)和轻链恒定区1(cl1)之外的重链恒定区2(ch2)和重链恒定区3(ch3)，并在重链恒定区中包括铰链(hinge)部分。此外，只要本发明的免疫球蛋白fc片段具有与天然型实际相同或改善的效果，可以是包括除了仅免疫球蛋白的重链和轻链可变区之外的重链恒定区1(ch1)和/或轻链恒定区1(cl1)的部分或全部的扩大的fc片段。另外，所述免疫球蛋白fc片段也可以是其中对应于ch2和/或ch3的一些相当长的氨基酸序列已被去除的区域。本发明的免疫球蛋白fc片段包括天然型氨基酸序列以及其序列衍生物(derivatives)。氨基酸序列衍生物是指具有与天然氨基酸序列至少1个不同的个氨基酸残基的序列，并可以是自然发生的或人工发生的。免疫球蛋白的fc片段包括通过缺失、插入、非互补或互补取代或其组合而成的衍生物。插入通常由大约1至20个氨基酸的连续序列组成，但更大的插入也是可能的。缺失通常由大约1至30个残基组成。制备这种免疫球蛋白fc片段的序列衍生物的技术公开在作为本说明书的参考而包括的国际专利公开wo97/34631号、国际专利公开wo96/32478号等。不完全改变分子活性的蛋白和肽中的氨基酸取代是本领域已知的(h.neurath，r.l.hill，蛋白(the proteins)，学院出版社(academic press)，纽约，1979)。最常见的取代是氨基酸残基ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、
ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thy/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu、asp/gly之间的取代。在一些情况下，所述免疫球蛋白fc片段可以通过磷酸化、硫酸化(sulfation)、丙烯酸化(acrylation)、糖基化(glycosylation)、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙酰化、酰胺化(amidation)等进行修饰(modification)。这样的免疫球蛋白fc片段可从诸如人、牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠等的动物体内中分离的天然形式中获得，并可以是从转化的动物细胞或微生物中获得的重组型或其衍生物。在此，从天然型获得免疫球蛋白fc片段的方法可以包括通过从人或动物的活体中分离整个免疫球蛋白，然后用蛋白分解酶进行处理来获得免疫蛋白fc片段。当用木瓜蛋白酶(papain)进行处理时，免疫球蛋白被切割成fab和fc，并当用胃蛋白酶(pepsin)进行处理时，免疫球蛋白被切割成pf'c和f(ab')2。可以对其使用体积排阻色谱法(size-exclusion chromatography)等来分离fc或pf'c。优选地，根据本发明的免疫球蛋白fc片段可以包括源自微生物的蛋白a、蛋白g、蛋白a/g或蛋白l。
43.在本说明书中使用的术语“z蛋白”获自金黃葡萄球菌(staphylococcus aureus)的蛋白a中，这是指用于对宿主细胞中存在的抗体进行防御作用的蛋白。所述z蛋白用于通过与宿主细胞中的抗体的fc部位结合，防止由巨噬细胞(macrophage)进行的吞噬作用发生的自我防御机制。通过仅操作蛋白a中的与抗体结合的部位而制成的串联重复二聚体(tandem repeat dimer)被称为“z-结构域”。
44.在本说明书中使用的术语“隐钙素(calsequestrin)”是肌质网(sarcoplasmic reticulum)的钙结合蛋白，尽管在肌质网中的钙浓度高于细胞质中的钙浓度，隐钙素在肌肉收缩后与钙结合并允许钙离子储存在肌质网的内胞浆网槽中。由于一个隐钙素分子可以结合复数个钙(例如，每个隐钙素分子具有40至50个钙结合部位)，因此其储存钙的能力非常好。
45.在根据本发明的核酸中，所述z-结构域的特征在于包括处于z-结构域重复的形式的zn(所述n是大于或等于1的整数)。例如，所述z-结构域可以是1个或多个、1个至20个、1个至10个、或1个至5个z-结构域重复的形式。优选地，所述z-结构域可以是2个至5个z-结构域重复的形式。
46.在根据本发明的核酸中，所述z-结构域的特征在于由seq id no：13的氨基酸序列组成，并且具有1至5个重复的形式。
47.在根据本发明的核酸中，所述z-结构域的特征在于为zz结构域、z6g结构域、或zl4g结构域。所述zz结构域可以包括seq id no：1的氨基酸序列或由seq id no：1的氨基酸序列组成。所述z6g结构域可以包括seq id no：2的氨基酸序列或由seq id no：2的氨基酸序列组成。所述zl4g可以包括seq id no：3的氨基酸序列或由seq id no：3的氨基酸序列组成。
48.在根据本发明的核酸中，所述隐钙素的特征在于包括seq id no：5或seq id no：6的氨基酸序列，或由seq id no：5或seq id no：6的氨基酸序列祖成。
49.在根据本发明的核酸中，所述z-结构域和所述隐钙素的特征在于通过一个接头(linker)融合，所述接头包括选自由seq id no：7至10组成的组中的一个或多个氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
50.在根据本发明的核酸中，所述抗体特征在于为包括能够特异性结合z蛋白的fc、其
id no：5或seq id no：6的氨基酸序列，或由seq id no：5或seq id no：6的氨基酸序列祖成。
63.在根据本发明的用于分离和纯化抗体的方法中，所述z-结构域和所述隐钙素的特征在于通过一个接头(linker)融合，所述接头包括选自seq id no：7至10组成的组中的一个或多个氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
64.在根据本发明的用于分离和纯化抗体的方法中,所述抗体特征在于为包括能够特异性结合zz蛋白的fc、其片段、其衍生物/类似物的抗体、抗体的片段、衍生物或类似物。例如，所述抗体可以为igg。
65.在根据本发明的用于分离和纯化抗体的方法中,所述步骤(d)特征在于在ph 3.0至ph 4.5的条件下进行。优选地，所述步骤(d)可以在ph 3.0至ph3.5的条件下进行。
66.在根据本发明的用于分离和纯化抗体的方法中，所述(d)使用钙分离结合至z-结构域和隐钙素的融合蛋白的抗体的步骤特征在于包括：
67.(d-1)使用钙沉淀结合至z-结构域和隐钙素的融合蛋白的抗体；以及
68.(d-2)通过离心或过滤除去沉淀物。
具体实施方式
69.除非在本说明书中另有定义，所有使用的技术和科学术语以与本领域普通技术人员通常理解的含义相同义，通过以下实施例且参照本发明附图更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不限于此。
70.《实施例》
71.实施例1.z结构域-隐钙素融合蛋白的制备
72.设计了包括由下表1中示出的氨基酸序列组成的z-结构域、接头以及隐钙素的z-结构域-隐钙素融合蛋白。一方面，作为比较例，使用注册专利第10-1774353号的融合蛋白。
73.【表1】
[0074][0075][0076]
实施例2.z-结构域-隐钙素融合蛋白的基因克隆
[0077]
为了将编码z-结构域-隐钙素融合蛋白的核酸克隆到作为表达载体的pet28b，使用聚合酶链式反应(pcr；polymerase chain reaction)进行增幅。为此，设计了正向引物(aataaaa catatg gtagacaacaaattcaac，序列号11)以及反向引物(att ctcgag tta atcatcatcatcatcatcttc，序列号12)(bioneer)。使用dna纯化试剂盒(ginol)纯化pcr产物，
并用ndei和xhoi限制酶(所述引物中的下划线标志部位，neb)进行处理。此外，pet28b载体(novagen)也用ndei和xhoi限制酶处理。用ndei和xhoi切割的dna片段和pet28b载体在16℃下使用连接酶(neb)连接12小时。将所连接的产物转染到dh5a大肠杆菌中后，在含有卡那霉素(kanamycin)的琼脂培养基中培养一天后，从生长的菌落中提取载体并进行排序(biooneer)。
[0078]
实施例3.z-结构域-隐钙素融合蛋白的表达和纯化
[0079]
将在所述实施例2中制备的质粒转化入大肠杆菌(escherichia coli)菌株bl21(de3)(novagen，诺森伯，英国)中。在37℃下，对细菌用1mm的异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)(sigma，圣路易斯，密苏里州)进行处理6小时来诱导转基因生物。然后，收获细菌并重新悬浮在裂解缓冲液(50mm的磷酸钠，ph 8.0、300mm nacl以及5mm咪唑)中，并通过超声波粉碎(sonication)来裂解。将裂解物在4℃下在1,550g离心1小时。将上清液加载到装有用裂解缓冲液(每1升培养液的床容量为3ml)预平衡(pre-equilibrated)的ni-nta亲和树脂(peptron，大田，韩国)的重力流色谱柱(gravity-flow column；biorad，赫拉克勒斯市，加利福尼亚州)。用10倍珠体积的裂解缓冲液洗涤色谱柱和基质后，洗脱并收获隐钙素。通过使用以磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph 7.4)预平衡的superdex 200色谱柱(amersham pharmacia，bucks，英国)的凝胶过滤法进一步纯化所述蛋白。
[0080]
《试验例》
[0081]
试验例1：确认包括由seq id no：5的氨基酸序列组成的隐钙素的融合蛋白的反应性和稳定性
[0082]
1-1.zz-csq1与zz-csq2(δ)的比较
[0083]
(1)确认钙反应性
[0084]
为了确认根据制备例1的zz-csq1(全部)融合蛋白和根据比较例的zz-csq2(δ)融合蛋白的浊度(turbidity)，将每种蛋白的浓度调整至1mg/ml来测量浊度。作为融合蛋白的缓冲液，使用20mm的tris-hcl(ph 7.0)，在融合蛋白中添加浓度调节为0mm、2mm、4mm、6mm、8mm、10mm和20mm的钙，然后混合并在4℃下进行反应1小时，使得融合蛋白能够与钙反应。使用nano-drop(thermo)在uv-vis(350nm)中测量每个浓度的吸光度值。结果，确认出，zz-csq1(全部)和zz-csq2(δ)分别在2mm和4mm的钙浓度下发生反应，并且根据制备例1的zz-csq1(全部)可以在低于zz-csq2(δ)的浓度中与钙进行反应来沉淀(图1)。
[0085]
(2)确认稳定性
[0086]
为了确认zz-csq1(全部)和zz-csq2(δ)的融合蛋白的稳定性，将浓度为1mg/ml的融合蛋白的zz-csq1(全部)和zz-csq2(δ)在37℃下的培养基中处理1天和2天。为了确认融合蛋白的稳定性随时间的变化，加入4x样品缓冲液，并在80℃下进行热处理10分钟后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)确认。结果，与zz-csq1(全部)相比，确认zz-csq2(δ)的分解随着时间的经过而增加(图2)。
[0087]
(3)确认根据接头种类的稳定性
[0088]
将作为zz-csq1(全部)融合蛋白的接头部分的g4s(seq id no：7)分别更改为4n(seq id no：8)、8n(seq id no：9)和le8n(seq id no：10)后，为了确认在1m naoh和cho细胞培养上清液(cell culture sup)中的稳定性，将根据制备例1至4的融合蛋白zz-csq1(全部)和zz-csq2(δ)中的每一种以1mg/ml的浓度在25℃和37℃下的培养基中处理12小时、24
小时、36小时和48小时。为了确认融合蛋白的稳定性随时间的变化，加入4x样品缓冲液，并在80℃下进行热处理10分钟后，通过sds-page确认。结果，zz-csq2(δ)融合蛋白在24小时后急剧或完全分解，相反，在接头分别被改变为4n、8n和le8n的根据制备例2至4的zz-csq1(全部)的情况下，在cho细胞培养上清液中具有高于或等于50％的稳定性，并在0.1m naoh中在24小时内具有高于或等于70％的稳定性，因此确认再使用率提高(图3)。
[0089]
1-2.测量zz-csq1(全部)融合蛋白对抗体的亲和力
[0090]
为了测量根据制备例1的zz-csq1(全部)融合蛋白的亲和力，进行表面等离子共振(spr；surface plasmon resonance)分析。将zz-csq1(全部)固定在cm5芯片上，并以30μl/min的流量将各种浓度(7.5nm、10nm、12.5nm、15nm和25nm)的贝伐珠单抗(bevacizumab)注入到50mm的tris和ph为7.4的缓冲溶液中。使用bia评估2.1软件(ge healthcare)分析动力学(kinetic)数据。结果，确认根据制备例1的zz-csq1(全部)的二价(divalent)z-结构域能够以1.39nm的亲和力与抗体强结合(图4)
[0091]
1-3.使用zz-csq1(全部)融合蛋白纯化抗体
[0092]
确认使用根据制备例1的zz-csq1(全部)融合蛋白在抗体培养液中仅纯化抗体的过程。将zz-csq1(全部)融合蛋白以1：1的比率加入抗体培养液中，并在4℃下反应30分钟。添加10mm的钙后，在4℃下反应30分钟，然后以4000g离心30分钟以分离出上清液(supernatant)和沉淀物(pellet)。为了在zz-csq1(全部) 抗体中洗脱抗体，使用50mm的柠檬酸盐(citrate)(ph 3.5)洗脱抗体。为了确认抗体回收程度，加入4x样品缓冲液(sample buffer)，并在80℃下热处理10分钟后，通过sds-page进行确认。结果，确认在根据制备例1的zz-csq1(全部) 抗体(igg)中仅洗脱了抗体(igg)(图5)。
[0093]
1-4.确认zz-csq1(全部)融合蛋白在各ph的抗体回收程度
[0094]
为了确认根据ph变化的抗体回收程度，以1：1加入根据制备例1的zz-csq1(全部)和抗体，并在4℃下反应30分钟，然后以180000g离心30分钟以分离出上清液(supernatant)和沉淀物(pellet)。将100mm的柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer)(ph 3.0、3.5、4.0和4.5)添加到zz-csq1(全部) 抗体(igg)复合物中并洗脱抗体。洗脱后，通过以4000g离心30分种以分离出上清液(supernatant)和沉淀物(pellet)，并为了确认抗体的洗脱程度，放入4x样品缓冲液并在80℃下加热10分钟，然后通过sds-page进行确认。结果，与ph为4.0和4.5时相比，确认出，回收缓冲液(recovery buffer)的ph为更酸性(ph 3.0和ph 3.5)时，抗体洗脱良好(图6)。
[0095]
1-5.使用zz-csq1(全部)融合蛋白进行抗体纯化后测量抗体的宿主细胞蛋白(hcp；host cell protein)
[0096]
在根据制备例1的zz-csq1(全部)融合蛋白的抗体回收后，进行测量以确认hcp。为了测量经纯化的抗体的hcp，使用cho hcp酶联免疫吸附剂测定(elisa；enzyme linked immunosorbent assay)试剂盒(canopy)。将100ul的通过使用zz-csq1(全部)洗脱的抗体样品添加到附着有anti-cho抗体的96孔板中，并在室温下反应1.5小时。用1x pbs-t每次以250ul洗涤3次后，加入100ul的报告抗体(reporting antibody)，并盖上盖子在室温下反应45分钟。用1x pbs-t每次以250ul洗涤3次后，加入浓度为0.1ug/ml的100ul的链霉亲和素(streptavidin)-辣根过氧化物酶(hrp；horseradish peroxidase)，并在室温下反应30分钟。用1x pbs-t每次以250ul洗涤3次后，用四甲替联苯胺(tmb；tetramethylbenzidine)处
理并反应10分钟。加入终止溶液(stop solution)，并使用酶标仪(microplate reader)在450nm处测量吸光度。结果，当使用根据制备例1的zz-csq1(全部)时，确认与蛋白a色谱法相比，hcp数值减少了1/4(图7)。
[0097]
1-6.在使用zz-csq1(全部)融合蛋白的抗体纯化后测量抗体的宿主细胞dna(hcd；host cell dna)
[0098]
在根据制备例1的zz-csq1(全部)融合蛋白的抗体回收后，确认hcp。为测量经纯化的抗体的hcp，使用quant-it ds dna高灵敏度检测试剂盒(high-sensitivity assay kit)(invitrogen)。将提供的工作溶液(working solution)处以避光的状态，加入200ul的工作溶液到微孔板(microplate)中，并在室温下保存3小时。将经纯化的抗体样品放入每个孔中并混合，并使用酶标仪(perkinelmer)测量荧光(fluorescence)(激发/发射最大值：480/530nm)。通过重复测量3次来进行确认。结果，确认出，在使用根据制备例1的zz-csq1(全部)时，与蛋白a色谱法相比，hcd数值减少了1/332(图8)。
[0099]
1-7.在使用zz-csq1(全部)融合蛋白的抗体纯化后测量分子排阻高效液相色谱(sec-hplc；size-exclusion high-performance liquid chromatography)
[0100]
在使用根据制备例1的zz-csq1(全部)融合蛋白的抗体纯化后，为了确认抗体或zz-csq1(全部)的聚集(aggregation)，通过sec-hplc进行确认。为了分析，使用superdex 200增加尺寸排阻色谱柱(sec；size exclusion chromatography column)。使用50mm柠檬酸盐(citrate)用作洗脱缓冲液，立即加入1m tris(ph9.0)以进行中和。以0.2ml/min的流速流动20mm的tris(ph 7.5) 150mm的nacl并进行分析，作为对照组，以蛋白a色谱柱纯化的抗体样品在相同条件下确认。结果，确认可以获得与蛋白a色谱法相当的抗体质量(图9)。
[0101]
1-8.确认在z6g-csq1(全部)和l4g-csq1(全部)的融合蛋白的抗体洗脱时的回收
[0102]
为了提高抗体回收率，通过在根据制备例1的zz-csq1(全部)中的zz结构域位置中改变为z6g(seq id no：2)和zl4g(seq id no：3)，从而制备了根据制备例5的z6g-csq1(全部)和根据制备例6的zl4g-csq1(全部)的融合蛋白。为了确认具有新结构域的融合蛋白的抗体回收率，分别以1：1的比率加入z6g-csq1(全部)和zl4g-csq1(全部)到抗体培养液中，并在4℃下反应30分钟。加入10mm的钙并在4℃下反应30分钟，然后以4000g离心30分钟以分离出上清液(supernatant)和沉淀物(pellet)。将50mm的柠檬酸盐(ph 3.5)和50mm的柠檬酸盐(ph 4.0)缓冲液加入沉淀物中，并洗脱20分钟。洗脱后，通过以4000g离心30分种以分离出上清液(supernatant)和沉淀物(pellet)，并为了确认抗体的洗脱程度，放入4x样品缓冲液并在80℃下热处理10分钟，然后通过sds-page进行确认。结果，确认出，与zzcsq1(全部)相比，将接头改变为z6g和zl4g后的抗体洗脱程度增加了10％。此外，确认出，在改变为根据制备例5的z6g-csq1(全部)和根据制备例6的zl4g-csq1(全部)后，相比于根据制备例1的zzcsq1(全部)，抗体的回收率提高(图10)。
[0103]
试验例2：确认包括由seq id no：6的氨基酸序列组成的隐钙素的融合蛋白的反应性和稳定性
[0104]
2-1.zz-csq2(全部)与zz-csq2(δ)的比较
[0105]
(1)确认钙反应性
[0106]
以与所述试验例1相同的方法测量根据制备例7的zz-csq1(全部)融合蛋白和根据比较例的zz-csq2(δ)融合蛋白的浊度和抗体洗脱，并且结果示于图11。
[0107]
(2)确认抗体回收率和纯度的提高
[0108]
为了确认zz-csq2(δ)和zz-csq2(全部)的融合蛋白的抗体洗脱回收率，将zz-csq2(δ)和zz-csq2(全部)的融合蛋白以1:1的比率加入抗体培养液中，并在4℃下反应30分钟。加入20mm的cacl2到抗体 融合蛋白中，并在4℃下反应30分钟，然后以4000g离心30分钟以分离出上清液(supernatant)和沉淀物(pellet)。将50mm的柠檬酸盐(ph 3.5)加入到沉淀物中，并洗脱20分钟。洗脱后，以4000g离心30分钟，并分离出上清液(supernatant)和沉淀物(pellet)。为了确认融合蛋白 抗体中的抗体洗脱程度，加入4x样品缓冲液，并在80℃下热处理10分钟后，通过sds-page进行确认。结果，确认出，使用zz-csq2(δ)回收大约60％的抗体，并在zz-csq2(全部)中，回收了大于或等于80％的抗体。此外，确认出，使用zz-csq2(δ)回收的抗体约有10％的zz-csq2(δ)融合蛋白一起回收，但在使用zz-csq2(全部)回收的抗体中，zz-csq2(全部)融合蛋白小于1％，因此可以回收高纯度的抗体。(图12)
[0109]
(3)确认根据接头种类的稳定性
[0110]
将作为zz-csq2(全部)融合蛋白的接头部分的g4s(seq id no：7)分别改变为4n(seq id no：8)、8n(seq id no：9)和le8n(seq id no：10)后，为了确认在1m naoh和cho细胞培养上清液中的稳定性，将zz-csq2(全部)和zz-csq2(δ)中的每一种以1mg/ml的浓度在25℃和37℃的培养基中处理12小时、24小时、36小时和48小时。为了确认融合蛋白的稳定性随时间的变化，加入4x样品缓冲液，并在80℃热处理10分钟后，通过sds-page进行确认。结果，在zz-csq2(全部)中的接头分别被更改为4n、8n和le8n的根据制备例8至10的zz-csq2(全部)的情况下，当在cho细胞培养上清液中24小时，稳定性提高至少25％，并在0.1m naoh中保持高于或等于50％的稳定性长达36小时，因此确认可以提高再使用率(图13)。
[0111]
2-2.使用zz-csq2(全部)融合蛋白的抗体纯化
[0112]
确认使用zz-csq2(全部)融合蛋白在抗体培养液中仅纯化抗体的过程。将zz-csq2(全部)融合蛋白以1：1的比率加入抗体培养液中，并在4℃下反应30分钟。添加20mm的钙后，在4℃下反应30分钟，然后以4000g离心30分钟以分离出上清液(supernatant)和沉淀物(pellet)。为了在zz-csq2(全部) 抗体(igg)中洗脱抗体(igg)，使用50mm的柠檬酸盐(ph 3.5)洗脱抗体。为了确认抗体回收程度，加入4x样品缓冲液，并在80℃下热处理10分钟后，通过sds-page进行确认。结果，确认在zz-csq2(全部) 抗体(igg)中仅洗脱抗体(igg)(图14)。
[0113]
试验例3.测量z-csq1(全部)融合蛋白对抗体的亲和力
[0114]
使用由seq id no：13组成的z-结构域代替在所述制备例1中由seq id no：1组成的zz结构域来制备z-csq1(全部)，并为了测量z-csq1(全部)融合蛋白的亲和力，进行spr(biacore 3000)分析。将赫赛汀(herceptin)固定在cm5芯片上，并以30μl/min的流量将各种浓度(30nm、60nm和90nm)的z-csq1(全部)注入到pbs缓冲溶液中。使用bia评估2.1软件(ge healthcare)分析动力学数据。结果，确认z-csq1的z-结构域也可以与抗体强结合(图15)。
[0115]
试验例4.测量(z)
5-csq1(全部)融合蛋白对抗体的亲和力
[0116]
为了测量具有5个z-结构域的(z)
5-csq(全部)的亲和力，进行spr(biacore 3000)分析。将赫赛汀固定在cm5芯片上，并以30μl/min的流量将各种浓度(0.96nm、1.96nm和3.84nm(z)
5-csq(全部)的注入到pbs缓冲溶液中。使用bia评估2.1软件(ge healthcare)分
析动力学数据。结果，确认(z)
5-csq(全部)的z-结构域也可以以1.14nm的亲和力与抗体强结合(图16)。
[0117]
试验例5：确认(z)
5-csq(全部)融合蛋白对抗体的抗体结合比率
[0118]
(z)
5-csq(全部)融合蛋白与抗体以0.5：1、1：1和2：1的比率加入，并在4℃下反应30分钟以使其能够结合。将钙加入到融合蛋白和抗体的反应溶液中，然后在4℃下以4000g离心30分钟。将上清液和沉淀物分开，并将沉淀物放入20mm tris-hcl(ph 7.0)缓冲液中且溶解后，为了确认融合蛋白的抗体结合比率程度，加入4x样品缓冲液并在80℃下热处理10分钟后，通过sds-page进行确认。结果，确认(z)
5-csq(全部)即使以2：1和4：1的比例也与抗体完全沉淀(图17)。
[0119]
目前为止，对于本发明，已经描述了其优选实施例。本发明所属领域的普通技术人员将理解，本发明可以在不脱离本发明的基本特征的情况下以修改形式实施。因此，所公开的实施例应被认为是说明性的而不是限制性的。本发明的范围由权利要求书而不是上述说明来表示，在与其等同的范围内的所有差异均应解释为包含在本发明中。