一种基于已分化卵巢快速规模化生产全雌黄河鲤的方法和应用

本发明属于水产动物遗传育种的，具体涉及一种基于已分化卵巢快速规模化生产全雌黄河鲤的方法和应用。

背景技术：

1、鲤，属于xx/xy染色体型鱼类。鲤生长性状存在明显的性别二态性，二龄的雌性个体比雄性个体生长速度快约30%(chen et al., identification and comparison ofgonadal transcripts of testis and ovary of adult common carp cyprinus carpiousing suppression subtractive hybridization. theriogenology 2015, 83(9):1416-1427.)，因此单性全雌鲤的养殖具有巨大的经济价值。

2、目前，全雌鲤的生产有3种途径：第一种方法是采用人工雌核发育技术直接获得全雌鲤（xiao et al., microsatellite analysis of different ploidy offspring ofartificial gynogenesis in cyprinus carpio. j fish biol 2011, 78(1):150-165.）。但有报道显示，雌核发育鱼的性腺出现发育迟缓，甚至有的鱼出现间性性腺或不育（刘文海, 鱼类人工雌核发育的研究进展[j].安徽农业科学，2008，36 (35)：15519-15521.）；liu等在鲤中也发现人工雌核发育鲤会出现性腺发育延迟现象（liu et al., 2007）；而且，在许多鱼类中的实验结果表明，人工诱导雌核发育技术存在以下问题：（1）二倍体苗种出现频率较低；（2）因染色体缺失或断裂等问题能存活至性成熟数量少（manan et al., a reviewof gynogenesis manipulation in aquatic animals. aquaculture and fisheries2022, 7(1):1-6.），因此，该方法无法满足大规模生产全雌鲤的需求。第二种方法是采用crispr/cas9基因编辑技术敲除鲤中cyp17a1a基因，该基因纯合敲除突变体无论染色体型为xx型还是xy型，全部发育为雄性，然后使用一对能够鉴定xx型和xy型雄性纯合突变体的性别特异分子标记鉴定出cyp17a1a基因纯合敲除的xx型雄鱼，将其与正常xx雌鲤人工授精，即可获得xx全雌鲤（zhai et al. successful production of an all-female commoncarp (cyprinus carpio l.) population using cyp17a1-deficient neomale carp.engineering 2022, 8:181-189.），但基因编辑动物尚没有得到国家批准，该方法暂不能用于实际生产。第三种方法是通过外源性激素如甲基睾酮或药物如芳香化酶抑制剂处理正常xx雌鲤，使其性反转为xx生理雄性鲤，再与正常xx雌鲤测交即可获得xx全雌鲤（wu et al.,production of all-female carp and its applications in fish cultivation.aquaculture 1990, 85(1):327.），相比第一种途径人工雌核发育获得的全雌鲤，第三种途径避免了因人工雌核发育技术缺陷导致的上述问题，也避免了外源性药物或激素对鱼食用安全的影响（mei & gui, genetic basis and biotechnological manipulation ofsexual dimorphism and sex determination in fish. science china life sciences2015, 58(2):124-136； 刘文海,2008）。但此类方法都是在鱼性腺未分化前或性别决定敏感期进行处理，此时动物个体小，药物耐受能力差，激素处理容易引起鱼苗的死亡，因此要求开始处理的时间、所用激素或药物的剂量及处理持续的时间都合适，才能取得理想的性反转效果，这限制了该方法的规模化使用。另有研究表明，使用甲基睾酮处理获得的性反转成鱼在当年极少量个体可产精液(hulak et al.,water polluted by 17α-methyltestosterone provides successful male sex inversion of common carp(cyprinus carpio l.) from gynogenetic offspring. journal of appliedichthyology 2008, 24(6):707-710.)，且会导致鱼性腺萎缩。因此，急需建立一种快速、有效并能规模化生产全雌鲤的技术方法。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种基于已分化卵巢快速规模化生产全雌黄河鲤的方法和应用。

2、本发明的技术内容如下：

3、本发明提供了一种基于已分化卵巢快速规模化生产全雌黄河鲤的方法，包括如下步骤：

4、1）亲本培育与筛选：经过培育并筛选出生长速度快、体型优美且健康的雌性黄河鲤作为后备亲本；

5、2）人工诱导黄河鲤雌核发育；

6、①人工挤压团头鲂的腹部取其精液进行灭活，具体操作如下：将精液与hanks’液混合稀释，置于低温环境中，之后置于摇床上并进行紫外灭菌灯照射，直至20%的精子灭活；

7、②取雌性黄河鲤的卵子进行人工授精，具体操作如下：在雌性黄河鲤的卵子中加入上述灭活的团头鲂精子，用干燥洁净的鸡毛轻轻搅拌混匀，加入23~25℃曝气后的自来水轻轻搅拌以刺激卵子，之后取卵子置于4℃的曝气后自来水中进行冷休克处理，置于室温曝气后的水中孵化，由于正常情况下团头鲂精子与黄河鲤卵子受精无法存活，且单倍体黄河鲤胚胎也不能存活，所以得到的幼苗均为xx全雌黄河鲤；

8、3）人工诱导性腺已分化为二期卵巢的雌鲤发生性反转；

9、待上述xx全雌黄河鲤的幼苗开口后，正常培育至孵化100天以上（可为100~150天），此时黄河鲤性腺已全部分化至二期卵巢阶段，开始投喂混有来曲唑的复合饲料，连续投喂3个月以上（可选3-6个月），检测出黄河鲤性腺出现精子细胞或精子，即发生性反转，随后采用商用饲料继续饲养，得到遗传雌性而生理雄性的xx伪雄鲤；

10、所述来曲唑的用量为100~300 mg/kg；

11、4）人工繁殖全雌鲤；

12、筛选正常培育的生长速度快、体型优美、且健康的雌性黄河鲤作为雌性亲本，步骤3）的xx伪雄鲤作为雄性亲本，对它们进行强化培育，具体操作如下：

13、在水温达到18~20℃时（不同省份的水温不一样，若在武汉，一般3月底就可以开始繁殖了，可以持续到4月底，若在河南，5月份还可以繁殖，繁殖根据水温，如果不及时做繁殖，鱼会自然流产），对上述亲本注射催产剂，进行黄河鲤人工繁殖，放入催产池中待产，进水阀打开，以小水流进行刺激，水温20℃时，效应时间约12小时，效应时间与水温呈负相关；当在催产池中观察到追逐繁殖行为时，每隔0.5小时检查一次繁殖池中是否有卵存在，如果发现繁殖池中出现鱼卵，将雄性亲鱼与雌性亲本分开，分别采集精液和卵子，采用人工授精的方法获得黄河鲤受精卵，并将其均匀铺在一个个20 cm×30 cm的60目塑料网片上，将网片吊挂与水泥池中自然孵化出鱼苗，即可获得全雌黄河鲤鱼苗；

14、所述催产剂为dom+lhrh-a2+hcg混合激素，剂量为dom 0.5~2 mg+lhrh-a2 2.5~10μg+hcg 250~1000 iu/kg体重；

15、所述催产剂的使用方式为采用背部肌肉注射方式催产；

16、雌鱼两次注射，两次间隔8-10小时，第一针在中午11-12时进行，注射剂量为总剂量的10%；第二针在20-21时进行，注射剂量为总剂量的90%；

17、雄鱼一次注射，注射时间与雌鱼第二针时间相同，剂量为雌鱼的一半。

18、5）规模化生产全雌鲤

19、待上述全雌黄河鲤鱼苗成长至80日龄（可为80~150日龄）以上时，采用步骤4）所述人工诱导性反转的方法培育更多的xx生理雄性鲤，待第三年繁殖季节时，所有鱼苗都能不同程度的挤出精液，用于全雌鲤规模化生产。

20、本发明还提供了一种基于已分化卵巢快速规模化生产全雌黄河鲤的方法在黄河鲤规模化以及商业化养殖中的应用。

21、本发明的有益效果如下：

22、本发明的基于已分化卵巢快速规模化生产全雌黄河鲤的方法，对性腺已分化为二期卵巢的120日龄的雌鲤投喂含有来曲唑的饲料，能够在3个月内获得能挤出精液的伪雄鲤，无需考虑传统人工诱导性反转技术要求的性别决定关键敏感期这一难点，并且存活率为100%，药物耐受能力强；以及本发明所采用的人工诱导性反转技术高效、快速、简单、易行，且能持续规模化生产全雌鲤，获得的xx伪雄鲤在7月龄时即可挤出有功能的精液，在第2年繁殖季节即可用于规模化生产全雌鲤。对正常授精获得的3月龄xx雌鲤采用该方法处理，能够实现所有雌鲤都性反转为xx伪雄鲤，且都能在第2年繁殖季节挤出有功能的精液，不再担心伪雄鲤不足及养殖维护成本等问题，可很好实现持续性规模化生产全雌鲤的需求，获得的全雌鲤全是正常人工授精而来，避免了外源性药物或激素对鱼食用安全的影响。而传统认知中，雌雄异体的鱼类在自然条件下不会发生性逆转，只会是一种性别-雄性或者雌性，一般认为发生了性别分化之后性腺不再具有可塑性，而本发明所述方法可以实现对已发生性别分化的鲤鱼发生性反转。