一种诱导金钗石斛组培苗开花的培养方法

本发明涉及药用植物组织培养，具体涉及一种金钗石斛种苗培育方法，尤其涉及一种诱导金钗石斛组培苗开花的培养方法。

背景技术：

1、金钗石斛(dendrobium nobile lindl.)，属兰科(orchidaceae)石斛属(dendrobium sw.)多年生附生草本植物，主要生长在热带、亚热带原始森林及气候相类似的温暖湿润环境中，惧怕霜冻及高温。金钗石斛茎秆两头细小，中间粗壮，整枝有压扁状，色泽金黄，其茎形如古代用来绾头发的“黄金发髻”首饰，故用“金钗”命名。

2、金钗石斛是我国传统名贵的中药材，药用始载于《神农本草经》，历版《中国药典》均有收载，位于九大仙草之首，历史上有“南石斛、北人参”之说。金钗石斛的茎和花都有很强的药用价值，以茎入药，性寒、味苦、微咸，具有增强免疫力、强阴益精、生津养胃、润肺止咳、抗肿瘤等功效；金钗石斛花能很好地滋阴润肺、养胃生津、明目清热，解郁，有增强免疫力、抗衰老功效，对呼吸道疾病、糖尿病、慢性肝炎、慢性胃炎等有好处。除药用价值外，金钗石斛花色鲜艳、花型独特，也具有很高的园艺观赏价值。随着人们生活水平的提高，身体和精神健康意识逐步增强，金钗石斛因其良好的保健功效和观赏价值而备受市场青睐。

3、但金钗石斛种子微小，胚发育不完全，在自然条件下极难出芽，野生资源锐减，加之长期采挖导致其种质资源短缺，已濒临灭绝，另外，由于兰花的幼年期比较长，达30个月，幼年期不能进行开花结果，所以金钗石斛花还具有花期短、产量低的特点，难以满足市场需求，往往需要借助人工繁殖技术进行辅助培育。应用植物组织培育方法进行金钗石斛的繁育虽能在一定程度上解决金钗石斛种苗短缺的现象，并能缩短营养生长向生殖生长转变的年限，但是若是以分株或腋芽繁殖，耗时长且繁殖系数低，中国专利cn 105532473 b公开一种金钗石斛种苗的组培方法，其通过建立间歇浸没液体培养系统，将外植体接种到含有ms培养液的间歇浸没式生物反应器中，限定参数后进行金钗石斛种苗繁殖，该方法具有增殖率高、自动化程度高、劳动量小、组培苗质量好、适应性强的特点。

4、现有技术虽能在一定程度上解决金钗石斛种质资源短缺的问题，但是仍然需要注意的一点是，常规的固体和液体组织培养技术仅在种苗的生产上发挥着重要的作用，很难诱导植株开花，开花数量少自然严重影响花的产量，从而会显著降低商品的价值，阻碍金钗石斛的产业发展。黄晶等人在“金钗石斛原球茎诱导试管开花研究”一文中指出，以金钗石斛原球茎为原材料，在培养基中添加细胞分裂素ba、苯基噻二唑基脲(tdz)和脱落酸(aba)诱导花芽发生，该文探讨了金钗石斛的试管开花过程，优化了其提早开花体系，并指出一定浓度的tdz和aba对花芽诱导效果更好，但是该方法最大的不足在于试管中开花植株茎叶不发达，仅有少部分花芽能够正常开花，开花率并不高，进而影响花的产量，且培养过程中需每月更换培养基，不仅工作量大，培养基更换过程中还会伤害组培苗根部，影响植株正常生长，进而影响培育效率。

5、综上可知，想要在达到较好的促金钗石斛开花效果的前提下，保证培育方法不受自然气候等不定因素的影响，并保证开花率稳定，解决促开花中花期调控的问题，且能同时提高操作便捷性和可重复性仍是本领域技术人员亟需研究解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种诱导金钗石斛组培苗开花的培养方法，操作便捷，可重复性高，具有明显的促开花效果，组培苗健壮，开花率高。

2、为了实现上述技术目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：一种诱导金钗石斛组培苗开花的培养方法，具体过程如下：

3、(1)配制改良液体培养基和tdz母液，灭菌后冷却待用；

4、(2)对间歇浸没式生物反应器的罐体进行灭菌处理，冷却待用；

5、(3)制备金钗石斛无菌外植体；

6、(4)营养生长培养阶段：无菌环境下，将金钗石斛无菌外植体接种到灭菌处理过的反应器的罐体中，向罐体中倒入无菌的改良液体培养基，组装好反应器，设置培养参数，放入组培室培养75～90d；

7、(5)诱导开花培养阶段：在无菌环境下，向罐体中的改良液体培养基内补充tdz母液，改变培养参数后放入组培室继续培养45～60d。

8、进一步地，步骤1)中，所述改良液体培养基为在改良ms液体培养基中分别添加质量浓度为0.1％的蛋白胨、质量浓度为8％的土豆汁和质量浓度为2.5％的蔗糖后复配而成，调节ph值为6.0。

9、进一步地，所述改良ms液体培养基以水为溶剂，其中各组分含量为：硝酸钾1425mg/l、硝酸铵1237.5mg/l、七水硫酸镁277.5mg/l、磷酸二氢钾127.5mg/l、氯化钙330mg/l、碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、四水硫酸锰22.3mg/l、七水硫酸锌8.6mg/l、二水钼酸钠0.25mg/l、五水硫酸铜0.025mg/l、六水氯化钴0.025mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、乙二胺四乙酸钠37.3mg/l、肌醇250mg/l、烟酸1.25mg/l、甘氨酸5mg/l、盐酸硫胺素1.25mg/l、盐酸吡哆醇1.25mg/l。

10、进一步地，步骤3)中，所述无菌外植体为采用固体组织培养法获得的原球茎或幼小组培苗。

11、进一步地，步骤4)中，无菌外植体的接种量为每升改良液体培养基接种10～15g原球茎或每升改良液体培养基接种300～500株组培苗。

12、进一步地，步骤4)中，营养生长培养阶段的培养参数为：浸没频率5min/4～6h、通气量2.5l/min；组培室的温度为25±1℃、相对湿度50～70％、光照强度1800～2200lux、光照周期14h/d。

13、进一步地，步骤5)中，向改良液体培养基中补充的tdz母液的初始浓度为1mg/ml。

14、进一步地，步骤5)中，补充tdz母液后改良液体培养基中的tdz的终浓度为1.5～3mg/l。

15、进一步地，步骤5)中，诱导开花培养阶段的培养参数为：浸没频率5min/8～10h、通气量2.5l/min；组培室的温度为20±1℃、相对湿度40～60％、光照强度2200～2500lux、光照周期16h/d。

16、本发明的有益效果为：

17、1、本技术公开的诱导金钗石斛组培苗开花的培养方法基于间歇浸没液体培养系统进行，整个培育过程主要包括营养生长培养和诱导开花培养两个阶段，通过限定各阶段培养参数后可达到明显的促开花效果，具有培养周期短、诱导开花率高的特点；

18、2、利用本技术公开的培养方法诱导金钗石斛组培苗开花，诱导开花率高，能明显提高金钗石斛花的产量，从而提高商品的药用价值和观赏价值，提升金钗石斛的经济性，可促进金钗石斛的产业发展；

19、3、本技术公开的培养方法基于间歇浸没液体培养系统进行，操作简便，自动化程度高，可重复性强，在整个培养过程中不用移动组培苗且不用更换培养基，较传统培育方法而言，省去了培养物的频繁转接和大批量组培瓶的罐装清洗过程，显著减少了工作量，降低生产成本，且整个培育过程中只需在诱导开花培养阶段添加一定浓度的植物激素即可，这种操作形式可保证组培苗不受伤害，显著提高培育效率；

20、4、与传统的固体组织培养法相比，利用间歇浸没式植物生物反应器进行金钗石斛外植体的培养可减少继代次数，降低变异率，且在培养过程中进行了充分的气体交换，减少甚至避免种苗玻璃化，繁殖得到的种苗更加健壮；

21、5、本技术公开的培养方法在室内条件下进行，培养过程不受自然气候等不定因素的影响，不仅开花率高，且开花率稳定，解决了促开花中花期调控的难点，金钗石斛开花不再受固定花期限制，不会出现“有花无市、有市无花”的问题。