一种掌叶覆盆子愈伤组织再生体系的建立方法

本发明涉及植物繁殖，尤其涉及掌叶覆盆子的愈伤组织再生体系的建立方法。

背景技术：

1、掌叶覆盆子（拉丁学名： rubus chingiihu），又名大号角公、华东覆盆子等，是蔷薇科悬钩子属浆果植物，为多年生小灌木。成熟果实富含氨基酸、矿物质mn 和zn、维生素c，类胡萝卜素和酚类等成分，其均易被人体吸收，具有改善新陈代谢、延缓衰老、提高免疫力等功效，尤其是抗衰老物质sod及抗癌物质（鞯化酸）含量高于现有栽培和野生水果[1]，且熟果色泽红润鲜亮、风味佳、含糖量高、营养丰富，是兼备鲜美口味与保健功效的新兴水果代表[2-5]。未成熟果实还可入药，是一种常用的中药，据本草纲目记载，它具补肝益肾，固精缩尿等功效[6-8]，还具有抗菌、消炎、舒精缓神和抗氧化等免疫学作用[7]。

2、 然而掌叶盆子种苗来源复杂，良种短缺，种子萌发率低，枝条扦插生根难，现主要通过根蘖繁殖。繁殖系数低，成为其产业发展的主要限制因子[15, 16]。植物组织培养体系的建立与优化是加快覆盆子良种快繁的有效途径[14]。前期已有学者对掌叶覆盆子的组织培养进行了初步研究，发现利用茎段可诱导不定芽的再生与增殖[8, 17-19]。刘计权[17]的研究结果表明，最适的诱导培养基为 ms + iba 0.3 mg/l+ ba 0.5 mg/l，最佳的继代培养基为ms + iba 0.1 mg/l + ba 1.0 mg/l + ga 0.05 mg/l，平均增殖系数在8以上；潘彬荣等[8]和 zhu 等[18]则发现，最佳诱导培养基为ms + ba 1.5 mg/l + naa 0.2~0.3 mg/l，最适分化培养基为 ms + kt 2.0 mg/l + naa 0.4~0.5 mg/l，增殖达 3.6~4.2 倍；汪秀媛等[14]等则确定最佳增殖培养基配方为：改良的 ms 培养基（2倍浓度的 ca、cu 和mn，1/4 mg和1/2 zn）+ ba 0.5 mg/l + kt 1.0 mg/l + naa 0.1 mg/l，试管苗增殖良好,生长健壮,能有效抑制玻璃化的产生。尽管掌叶覆盆子的组织培养方面已有诸多报道，但其基本都以茎段枝条等为实验材料，以诱导腋芽萌发建立组织快繁体系，而愈伤组织再生体系却一直未见有报道。

3、 掌叶覆盆子有较高的经济价值、药用价值和研究价值，但目前悬钩子属植物的愈伤组织再生体系并不适用于掌叶覆盆子。现有关于掌叶覆盆子的组织培养研究基本都以茎段枝条为材料，诱导腋芽萌发来获得掌叶覆盆子株系，从而建立愈伤组织快繁体系，但这并非组织再生体系，无法进行掌叶覆盆子的快速繁殖和良种繁育，这大大延误了覆盆子的育种进程。因此，亟需开发一套快速高效的愈伤组织再生体系，为掌叶覆盆子的良种快繁和科学研究提供参考。

4、参考文献

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19、[15]江景勇，陈珍，卢秀友，等. 掌叶覆盆子根插快繁育苗技术 [j]. 浙江农业科学, 2013, (02): 145-6.

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22、[18]weijun zhu*， senfu xu y c. research on rapid propagation anddomestication of wild raspberry plantlets [j]. agricultural sciencetechnology, 2016, 17(02): 298-300.

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技术实现思路

1、本发明提供了掌叶覆盆子愈伤组织再生体系的建立方法，为掌叶覆盆子的无性繁殖提供技术支持。

2、具体技术方案如下：

3、本发明提供了一种掌叶覆盆子愈伤组织再生体系的建立方法，包括：

4、（1）以在无菌培养基上生长良好的掌叶覆盆子苗的幼嫩叶片为外植体材料，之后将该幼嫩叶片切为合适大小，接种至诱导愈伤的培养基中培养，得到含有愈伤的外植体；

5、所述诱导愈伤的培养基为：ms + 3% 蔗糖 + 3g/l 植物凝胶 + 0.05 mg/l iba +0.5 mg/l tdz, ph = 5.7 ~5.8；

6、（2）将长出愈伤的外植体移至新鲜的培养基中进行培养，在黑暗培养2周后，培养基的配方如（1），诱导不定芽的产生，培养 3-5 d后愈伤组织出现芽状生长点，随后一周内出现明显可见的小芽；

7、（3）将出现小芽的材料再移至新鲜培养基中培养生长，培养12-16 d，使材料长出的小芽更粗更大更健壮；所用培养基配方为：wpm + 3% 蔗糖 + 3 g/l 植物凝胶 + 0.1mg/l iba + 0.1 tdz mg/l，ph = 5.2 ±0.02；

8、（4）将所述不定芽移至生根培养基中进行生根培养，生根培养基配方为：wpm + 2%蔗糖+ 3 g/l 植物凝胶 + 0.2 mg/l iba + 0.05 mg/l kt + 0.5 g/l 活性炭，ph = 5.2±0.02。炼苗后，移栽到草碳土中，得到掌叶覆盆子再生苗。

9、本发明在实验初期，我们收集了已发表的悬钩子属植物相关的组织再生方法，并在掌叶覆盆子上进行了尝试，发现已有的悬钩子属植物再生体系并不适用于掌叶覆盆子，不能促使该覆盆子外植体长芽等。因此，我们从头摸索配方，并进行了多种配方的优化，发明了适用于掌叶覆盆子的愈伤组织高效再生体系，为掌叶覆盆子的良种扩繁提供了新途径。

10、本发明中，“wpm”是指木本植物培养基；“iba”是指吲哚丁酸；“tdz”是指噻苯隆；“6-ba”是指6-苄氨基腺嘌呤；“naa”是指萘乙酸；“kt”是指激动素。

11、 外植体选择在无菌条件下生长良好的掌叶覆盆子苗的幼嫩叶片。作为优选，步骤（1）中，诱导愈伤的培养条件为：每天23℃条件下黑暗培养，培养14 d，利于提高愈伤组织的诱导率；

12、作为优选，步骤（1）中，所述外植体材料处理方式为：叶片除去边缘部分切为0.8cm*0.4左右的四边形；利于提高愈伤组织的诱导率；

13、作为优选，步骤（1）中，所述外植体接种方式为：叶片平铺在培养基表面，叶片正面朝下；利于提高愈伤组织的诱导率；

14、作为优选，步骤（2）中，不定芽诱导培养条件为：每天23℃条件下光照培养16 h，每14 d继代一次；利于提高不定芽的诱导率；

15、作为优选，步骤（3）中，再生芽诱导培养条件为：每天23℃条件下光照培养16 h，培养2周左右；利于提高再生芽的存活率；

16、作为优选，步骤（4）中，生根培养的条件为：每天23℃条件下光照培养16 h，光照强度为5000 lx~7000 lx；利于提高生根率。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、（1）使用本方法，掌叶覆盆子从愈伤组织诱导到土壤再生成活，整个周期仅为2-3个月，用时较短；

19、（2）本发明针对掌叶覆盆子的不定芽诱导培养，用同一种诱导培养基可以完成愈伤组织诱导和不定芽再生，简化了操作程序；

20、（3）本发明针对掌叶覆盆子再生芽的培养，发现了一种新的培养基，使再生芽长的更快更大更粗，缩短了时间，增大了再生芽存活的可能；

21、（4）愈伤组织、不定芽和根的诱导率高，分别为100%、100%、92.86%；

22、（5）本发明中掌叶覆盆子的幼嫩枝条作为外植体，材料获得比较容易。