一种快速繁育单子叶植物绿萝的方法与流程

本发明涉及一种快速繁育单子叶植物绿萝的方法，属于植物快速繁殖。

背景技术：

1、绿萝(scindapsus aureus)，属天南星科麒麟叶属常绿藤本植物，为单子叶植物。在室内外观赏、景观装饰、净化空气、净化水体等方面，具有很高的观赏和生态价值。

2、目前，绿萝的繁殖方式主要是扦插，存在繁殖系数低、生长速度慢、遗传稳定性差等缺点。组织培养是实现绿萝快速繁殖的有效途径，近年来的研究主要以绿萝茎段为外植体，通过愈伤组织分化或直接诱导生芽的方式获得绿萝再生植株。但是由于外植体选材的局限性和植物生长调节剂对再生影响的复杂性，现阶段绿萝组培还存在再生频率低、成本偏高、对操作者的技术要求相对高等缺点。为了满足社会经济发展对绿萝的大量需求，同时克服现有繁殖方式的不足，需要研发出一种快速有效简便的绿萝快繁方式。

3、研究表明，有些植物可以实现开放条件下的非组培再生，如叶插再生。叶插是利用植物具有再生能力的叶片或叶片的一部分进行扦插，在插穗基部、边缘或正中发生不定芽和不定根，形成新植株个体的繁殖方法。叶插易于操作，成活率高，成本低，叶插苗根系完整，出苗整齐。目前，只有秋海棠属、草胡椒属、苦苣苔科一些植物以及单子叶植物虎皮兰等少数植物可以叶插繁殖。绿萝开放条件下的非组培再生尚未见报道。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种快速繁育单子叶植物绿萝的方法。利用绿萝特定组织细胞具有全能性的特点，在开放条件下使用液体培养基诱导绿萝离体叶片特定部位分裂分化，产生再生根和再生芽，最终形成植株。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、一种快速繁育单子叶植物绿萝的方法，包括以下步骤：

4、(1)从母株上切取叶龄10-40天、健康无明显病虫害、来自主茎或侧枝的绿萝叶片，得到离体绿萝叶片；

5、(2)对离体绿萝叶片进行处理：清洗后对叶柄进行修剪，削成楔形状；

6、(3)对处理后的离体绿萝叶片进行培养：将叶面部分放于泡沫板上，叶柄部分浸泡于液体培养基中培养；

7、(4)待离体叶片生根发芽后，将离体叶片移出进行土培，常规管理。

8、其中切取绿萝叶片的方式：用锋利的双面刀片自下而上快速切离叶片，切取点位于叶柄下部，与茎相接处距离2-3mm；离体绿萝叶片不含腋芽及其临近组织。

9、离体绿萝叶片处理的具体步骤：

10、1)清洗：先用干净的自来水仔细清洗整个叶片2-3次，再用蒸馏水润湿的医用脱脂棉擦洗整个叶片2-3次，最后用蒸馏水清洗整个叶片2-3次；

11、2)修剪：用锋利的双面刀片快速将叶柄削成楔形，在阴凉处将修剪后的叶柄暴露于空气中3-4分钟，整个过程要避免叶片受到损伤。

12、若处理好的叶片无法立即水培，将叶片用干净湿润的滤纸包裹，叶柄处用湿润的医用脱脂棉包裹，放置于种子发芽盒中，存放于阴暗处备用。

13、处理后的离体绿萝叶片培养的步骤：

14、1)向种子发芽盒中倒入1/4体积的液体培养基，并在液体培养基液面上放置泡沫板；

15、2)将处理后的离体绿萝叶面部分放于泡沫板上，叶柄部分浸泡于液体培养基中；种子发芽盒放入干净自封袋中，不密封袋口；培养温度为24±2℃，光照强度为800lx，光照时间为8h/d。

16、所述液体培养基为：在1/8ms基础液体培养基中加入pvp，pvp浓度为500mg/l，ph为6.0，具体组成为：237.5mg/l kno3、206.25mg/l nh4no3、21.25mg/l kh2po4、46.25mg/lmgso4·7h2o、55mg/l cacl2·2h2o、0.104mg/l ki、0.775mg/l h3bo3、2.79mg/l mnso4·4h2o、1.075mg/l znso4·7h2o、0.03125mg/l na2moo4·2h2o、0.003125mg/l cuso4·5h2o、0.003125mg/l cocl2、4.6625mg/l na2·edta·2h2o、3.475mg/l feso4·7h2o、12.5mg/l肌醇、0.25mg/l甘氨酸、0.0125mg/l vb1、0.0625mg/l vb6、0.0625mg/l vb5。

17、离体绿萝叶片培养过程中，更换液体培养基2次，每隔20天更换1次；离体叶片土培时，基质采用田园土。

18、本发明有益效果：

19、1.本发明的绿萝叶片再生方法，利用绿萝特定组织细胞具有全能性的特点，在开放条件下，使用专用水培液诱导绿萝离体叶片特定部位分裂分化，产生再生根和再生芽，最终形成植株。该方法不需无菌环境，取材方便，操作简便、成本低、周期短、成活率高，具有高效、经济、易于规模化、工厂化等优点；形成再生苗的成功率达88％以上，再生植株移栽成活率达95％以上。该方法在绿萝快速育苗、特定材料保存与繁殖等领域具有较大应用价值。

20、2.本发明建立的绿萝离体叶片再生体系，与之前传统的组培再生体系显著不同。该再生途径为外植体直接诱导不定芽再生途径，遗传稳定性则更好。植物组织培养的途径通常是外植体脱分化产生愈伤组织，愈伤组织分化产生芽，最后生根，生根往往难于生芽。在愈伤组织培养过程中有一定概率发生突变不能保持一致的遗传特性，并且愈伤组织并不都有再生能力产生再生苗。

21、本发明中在开放条件下，绿萝离体叶片再生的大致过程是：先形成不定根，后形成不定芽。这种再生体系具有鲜明的特点：不定根吸收营养和水分，离体叶片进行光合作同，形成了一个相对独立完整的再生体系，确保了再生的高效性。

22、3.本发明采用液体培养基培养绿萝的方式，提高了再生率。植物培养基一般分为固体培养基和液体培养基。固体培养基培养植物材料是最常用的方法，虽然该方法简单易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，常有褐化中毒现象发生。液体培养基具有较好的流动性，可以更精确地控制溶液温度、营养成分浓度以及气体含量等。此外，液体培养基能够更快地使外植体产生的褐变产物及时稀释分散，降低外植体周边有毒物质的含量及浓度，能够有效减轻其毒害作用。液体培养基的另一个优点是经济高效，与固体培养基相比，液体培养基要求植物组织的附着能力更小，可以使植物组织在其中悬浮，植物组织与液体培养基紧密接触，刺激和促进了植物组织对营养元素和激素的吸收，以获得更好的营养和生长环境，从而促进外植体的快速生长和扩增。

23、本发明采用的1/8ms液体培养基，大幅度降低大量元素的培养方式，有效提高了再生率。现有研究表明，高浓度的大量元素会降低植物再生诱导率，且过高的金属离子含量对植物分化具有抑制作用。但是大量元素过低会导致营养不足生长停滞。另外，培养基中无机盐(大量元素)含量较低，能够在一定程度上防止外植体的褐变，提高再生率。详见实验例1。

24、4.本发明采用无糖培养方式，促进了绿萝再生。植物组织培养基通常需要添加蔗糖。蔗糖主要是作为碳源和能源，供植物组织或细胞使用。但是研究表明，绿萝是耐贫瘠的植物，对营养和能量消耗较少。绿萝离体叶片本身含有一定量的糖可供分解利用，培养过程中绿萝离体叶片可以依靠光合作用，合成糖类供自身使用。外源蔗糖的添加，或许会导致培养体系中糖类过度积累的现象，从而抑制再生。详见实验例2。

25、5.本发明采用无植物生长调节剂培养方式，显著提高再生效果。在组织培养中，植物组织或细胞往往缺乏合成生长素和细胞分裂素的能力，需要添加外源生长素和细胞分裂素，在这两种激素的共同作用下，调节组织内部和体细胞胚胎发生的内源激素的代谢和平衡，完成细胞生长、分化和分裂。一般认为，外源激素是通过内源激素发挥作用的。若外源激素种类及浓度不合适，会抑制外植体内源激素的活性，从而阻止器官的发生，外源激素的添加打破了已经形成稳态的内源激素体系，导致再生失败。绿萝离体叶片在培养过程中本身会合成一定量的内源激素(包括生长素和细胞分裂素)，各内源激素彼此影响，达到动态平衡，从而促使再生的发生。故本发明采用无植物生长调节剂的方式进行培养。详见实验例3。

26、6.本发明添加适量抗褐化剂pvp，能有效抑制褐化，提高再生效果。褐化现象是植物组培中的常见问题。植物组织褐化是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，导致酚类化合物在细胞中集聚成深色大分子，从而导致培养基的逐渐褐变，进而导致外植体的褐化甚至死亡。褐化现象也是天南星科观赏植物组培中常见的问题。研究发现，绿萝组培褐变的现象较严重，需要适量添加抗褐化剂(如活性炭)。因为本发明采用液体培养基培养，不宜选择活性炭，故选用其他水溶性抗褐化剂。实验结果表明，pvp(聚乙烯吡咯烷酮)是绿萝离体叶片的再生诱导较适宜的抗褐化剂。pvp属于酚类物质的吸附剂，通过吸附特定种类的酚类化合物而降低植物褐化程度。虽然酚类物质对植物褐化有着加剧作用，但同时也是植物生长所必需的物质，而pvp并未完全吸附植物体内酚类物质故使得丛生芽可以更良好的生长。详见实验例4。

27、7.植物组培采用液体培养基培养方式，会存在以下弊端：(1)植物培养需要一定的营养物质和生长因子来维持细胞生长和分裂等过程，而这些物质会随着时间和细胞数量的增加而逐渐消耗。如果不及时更换培养基，营养物质和生长因子的浓度会逐渐降低，最终导致细胞停滞生长或死亡。(2)培养基中还会产生一些代谢产物和毒性物质，如过多酚类物质、乙酸和过氧化氢等，如果不及时更换培养基，这些物质也会逐渐积累并影响细胞的生长和分裂等过程。因此，需要定期更换液体培养基。但是液体培养基更换次数，并非越多越好。过于频繁更换次数，会破坏已经形成的内外新陈代谢动态平衡。结果表明，开放条件下绿萝离体叶片再生，液体培养基更换2次较为合适。详见实验例5。

28、8.本发明采用spss24软件进行统计学分析，得到开放条件下绿萝离体叶片再生诱导发生的适宜条件，结果更加准确可靠。详见实验例6。