一种使用扫描电镜辐射诱变育种方法

本发明属于一种辐射诱变育种方法，涉及构建一种使用扫描电镜辐射诱变育种方法，具体涉及利用扫描电镜在真空环境中直接进行作物种子胚不同部位的精准辐射，并通过植物组织培养技术进行无菌播种，精准辐射并提高辐射后种子成活率的方法。

背景技术：

1、诱变育种技术被用于提高世界上重要作物的产量、质量和适应性，在解决许多国家的粮食和营养安全问题方面发挥了重要作用。辐射诱变是培育作物新品种及创制新种质的一种有效方法，电子束是常用的诱变源之一。电子束辐射具有处理时间短、能耗低，不产生核废料等优点，而扫描电镜会利用聚焦的很窄的高能电子束来扫描样品。扫描电镜的电子束定位精准，操作便捷，可以准确定位到种子胚的一些部位进行辐射。因此，可以利用扫描电镜精准辐射作物种子的胚芽等部位进行辐射诱变，降低的辐射设施门槛，建立扫描电镜辐射诱变育种的工艺流程。

2、高剂量辐射会损伤植物细胞并导致死亡，辐射剂量过低又不能达到很好的诱变效果。目前常见作物的植物组织培养技术日益成熟，结合组织培养技术进行无菌播种，为种子萌发提供最佳环境，相对辐射后直接播种，可以有效提高辐射损伤后种子成活率。

技术实现思路

1、本发明通过扫描电镜进行准确定位辐射部位、精准辐射，并与植物组织培养相结合，为促进辐射后作物种子恢复、提高辐射诱变效率、高效创造作物新种质提供新的思路。先通过扫描电镜的观测功能精准定位要辐射种子胚的不同部位进行辐射，控制灯丝电压、灯丝电流、放大倍数、辐射时间调节扫描电镜参数。提高辐射目标部位的辐射剂量，降低局部辐射过量导致的种子死亡率，增加高剂量辐射后种子成活率，提高作物种子的突变概率。结合组织培养技术，进行无菌播种，为种子提供最佳生长条件，提高辐射损伤后种子萌发率，增加高剂量辐射后种子成活率，提高作物种子的突变概率。

2、所述扫描电镜精准辐射作物种子诱变育种方法，包括以下步骤：

3、1)在扫描电镜下可直接定位胚结构的种子直接观测定位和辐射，不能直接定位胚结构的种子采用石蜡固定后通过石蜡切片机或者直接手术刀横切，露出胚结构，便于观测定位和辐射；所述的扫描电镜为热发射型扫描电镜或场发射型扫描电镜；

4、2)直接将种子放置到扫描电镜样品室中，抽真空，调节电流20～60na，电压10～30kv、放大倍数40～1000倍并利用扫描电镜精准定位种子胚进行辐射，辐射时间0.5～2.5min；

5、3)真空辐射处理后种子消毒后播种到1/2ms培养基中，放入暗室暗培养后转入培养室内培养；

6、4)每个处理选取长势较好、生长相对一致的植株，待长出2片及以上真叶且根部较发达时，进行炼苗，完成炼苗的作物苗移栽到温室大棚内的花盆中，所用基质按草炭∶蛭石∶珍珠岩＝2∶1∶1体积比混合，定植后栽培至开花结果。

7、5)通过形态指标对突变个体进行表型鉴定，通过变性梯度凝胶电泳法进行基因鉴定。

8、本发明更优的方案，所述的种子可以是番茄、茄子、辣椒、生菜、白菜、萝卜、甜瓜等作物种子，且种子可以横切方便观测定位和辐射。

9、本发明更优的方案，所述的辐射部位为种子胚的胚芽部分，对辐射相对敏感，且发生突变后易观察易遗传。

10、本发明更优的方案，所述热发射型扫描电镜为钨灯丝扫描电镜或六硼化镧灯丝扫描电镜；场发射型扫描电镜为肖特基热场发射扫描电镜或冷场发射扫描电镜。

11、本发明更优的方案，所述的1/2ms培养基中琼脂调整为4.5g/l更适合辐射后种子萌发。

12、本发明更优的方案，所述的辐射效果和最佳辐射剂量通过半致死剂量，结合苗期游离脯氨酸和丙二醛含量上升最显著时剂量确定。

13、本发明更优的方案，所述的形态指标包括：冠幅直径、株高、茎粗、叶片大小、叶片形状、花色、果实大小和果实形状。

14、本发明的优点和有益效果如下：

15、(1)本发利用扫描电镜的高能电子束能高效地对作物种子胚不同部位进行精准辐照，提高辐射目标部位的辐射剂量，降低局部辐射过量导致的种子死亡率，增加高剂量辐射后种子成活率，提高作物种子的突变概率，且扫描电镜产生辐射精准可控，辐射处理操作简单安全，不产生核废料，扫描电镜相对放射性元素材料更常见。

16、(2)本发明还结合优化的组织培养技术对辐射的种子进行萌发，提高辐射后种子的成活率，提高种子半致死剂量，增加诱变成功率。

技术特征：

1.一种扫描电镜精准辐射作物种子诱变育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的扫描电镜精准辐射作物种子诱变育种方法，其特征在于，所述的种子是番茄、茄子、辣椒、生菜、白菜、萝卜或甜瓜的种子，且种子可以横切方便观测定位和辐射。

3.根据权利要求1所述的扫描电镜精准辐射作物种子诱变育种方法，其特征在于，所述的辐射部位为种子胚的胚芽部分。

4.根据权利要求1所述的扫描电镜精准辐射作物种子诱变育种方法，其特征在于，所述热发射型扫描电镜为钨灯丝扫描电镜或六硼化镧灯丝扫描电镜；场发射型扫描电镜为肖特基热场发射扫描电镜或冷场发射扫描电镜。

5.根据权利要求1所述的扫描电镜精准辐射作物种子诱变育种方法，其特征在于，所述的1/2ms培养基中琼脂调整为4.5g/l。

6.根据权利要求1所述的扫描电镜精准辐射作物种子诱变育种方法，其特征在于，步骤2)中辐射效果和最佳辐射剂量通过半致死剂量，结合苗期游离脯氨酸和丙二醛含量上升最显著时剂量确定。

7.根据权利要求1所述的扫描电镜精准辐射作物种子诱变育种方法，其特征在于，形态指标包括：冠幅直径、株高、茎粗、叶片大小、叶片形状、花色、果实大小和果实形状。

技术总结本发明提供了一种使用扫描电镜辐射诱变育种的方法，本发明属于辐射诱变育种领域，先通过控制灯丝电压、灯丝电流、放大倍数、辐射时间调节扫描电镜辐射参数，再利用扫描电镜的观测功能精准定位要辐射种子胚的不同部位进行辐射，最后结合植物组织培养技术进行无菌播种，是一种精准辐射并可提高辐射后种子成活率的方法。本发明方法可用于番茄、茄子、辣椒、生菜、白菜、萝卜、甜瓜等作物种子的高效辐射诱变育种。技术研发人员：赵春莉,程志强,汪鑫,曲同宝,李明静,韩櫂濂受保护的技术使用者：吉林农业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/11