一种有益附生真菌与致病菌依次联用控制五爪金龙的方法

本发明涉及入侵植物防控，具体为一种有益附生真菌与致病菌依次联用控制五爪金龙的方法。

背景技术：

1、五爪金龙是一种多年生常绿藤本植物，主要分布在中国华南地区，是该地区最具危害性的入侵植物物种之一，该物种抗病性强，在自然环境中鲜有病害发生，主要以根、茎等进行营养体克隆繁殖，具有生长快和竞争力强的特征，对田间农作物和华南地区的植物多样性造成了巨大危害。

2、当前五爪金龙的防控主要采用人工清除法、化学防治法和生物防治法。人工清除法对人力、物力的投入要求高，效率低，清除过程中遗留下来的根、茎等残体极易在原地再生。化学清除法对五爪金龙有较好的防控效果，但化学农药的施用会造成严重的环境污染。五爪金龙在自然生境中偶而会出现非常轻微的胶孢炭疽菌感染的症状。因此，有人提出利用该菌种对五爪金龙进行生物防控的设想。然而，胶孢炭疽菌属于五爪金龙的低致病力病原菌，单纯施用胶孢炭疽菌不足以使该植物发生严重的疾病症状，从而无法达到防控该植物的目的。研究发现，五爪金龙对胶孢炭疽菌的强抗性与该植物叶面上有益附生真菌(g.fujikuroi)的共生密切相关，因此提出了先清除g.fujikuroi以削弱该植物的抗病性，再利用胶孢炭疽菌感染免疫力衰弱后的五爪金龙植株的防控理念。然而，清除这个附生菌种使用的化学杀菌剂存在巨大的环境污染风险。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明提供了一种有益附生真菌与致病菌依次联用控制五爪金龙的方法，包括以下步骤：

2、s1、激发过度免疫，将浓度为3×107个/ml的g.fujikuroi孢子悬浮液喷施于五爪金龙植株叶片上，每个叶片喷施量为2.5ml，将五爪金龙植株置于温度为25±5℃、相对湿度为85±5％的环境条件下2d；

3、s2、免疫力衰落，等待3d；

4、s3、施病菌致病，将浓度为2×106个/ml的胶孢炭疽菌孢子悬浮液喷施于五爪金龙植株叶片上，每个叶片喷施量为2.5ml，等待2d。

5、优选的，g.fujikuroi的分离、纯化方法如下：

6、采集生长旺盛的五爪金龙植物种群，从植株的茎上选取颜色鲜绿、无病害的叶片，将8个叶片置于250ml锥形瓶中，加入75ml无菌水，用封口膜密封锥形瓶瓶口，将锥形瓶放置在摇床上170rpm震荡60min，在超净工作台中用无菌枪头吸取200μl悬浮液，接种到无菌pda培养基上，涂布均匀，所有的平板倒置后置于26℃的培养箱中避光培养7d，将pda培养基上的每个菌落挑出，转接到新的无菌pda培养基上进行纯化培养2-3代。

7、优选的，胶孢炭疽菌的分离、纯化方法如下：

8、采集已经感染胶孢炭疽菌感染症状的五爪金龙病叶，用无菌处理过的刀片切取五爪金龙表面的叶斑，并转移至无菌pda培养基上，置于26℃的培养箱中避光培养7d，将pda上的每个菌落挑出，转接到新的无菌pda培养基上进行纯化培养2-3代。

9、优选的，pda培养基通过200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂，0.1g硫酸链霉素，1000ml去离子水制成。

10、优选的，真菌孢子悬浮液的制备方法如下：

11、将纯化后的菌落从pda培养基分别转接至无菌pdb培养基，pdb培养基由马铃薯200g，葡萄糖20g，1000ml去离子水制成，然后置于26℃、无光照的培养箱内培养24h，真菌培养液经过三层无菌纱布过滤得到孢子悬浮液母液，将这两种母液分别转移至50ml离心管，在离心机内4000rpm离心10min，使孢子沉淀于离心管底部，弃去离心管上层的pdb，再向离心管内加入无菌水，振荡离心管得到真菌孢子悬浮液。

12、本发明具如下有益效果：

13、创建一种以低致病力胶孢炭疽菌作为五爪金龙生物防控菌的新技术，且无需使用化学杀菌剂即可削弱该植物免疫力的绿色新途径，通过使用五爪金龙的有益附生真菌(g.fujikuroi)在较短时间内即可实现对五爪金龙植物过度免疫的激发及其随后免疫力衰减的目的，避免了直接通过化学杀菌剂清除这个有益附生真菌(g.fujikuroi)来削弱五爪金龙免疫力所造成的环境污染。

14、该方法中使用低致病力的胶孢炭疽菌即可对五爪金龙造成严重的病害，使该低致病力菌种能够满足作为五爪金龙生物防控菌的要求，解决了五爪金龙天然高致病力生物防控菌种严重匮乏的现实问题。

15、该方法中有益附生真菌和病原菌菌种均可以从五爪金龙自身的叶片中分离出来，分离方法简单，各菌种孢子悬浮液制备所需的设备简单、产量高、成本低。

技术特征：

1.一种有益附生真菌与致病菌依次联用控制五爪金龙的方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种有益附生真菌与致病菌依次联用控制五爪金龙的方法，其特征在于：g.fujikuroi的分离、纯化方法如下：

3.根据权利要求1所述的一种有益附生真菌与致病菌依次联用控制五爪金龙的方法，其特征在于：胶孢炭疽菌的分离、纯化方法如下：

4.根据权利要求2或3所述的一种有益附生真菌与致病菌依次联用控制五爪金龙的方法，其特征在于：pda培养基通过200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂，0.1g硫酸链霉素，1000ml去离子水制成。

5.根据权利要求2或3所述的一种有益附生真菌与致病菌依次联用控制五爪金龙的方法，其特征在于：真菌孢子悬浮液的制备方法如下：

技术总结本发明涉及入侵植物防控技术领域，具体为一种有益附生真菌与致病菌依次联用控制五爪金龙的方法，包括以下步骤：S1、激发过度免疫，将浓度为3×10<supgt;7</supgt;个/ml的G.fujikuroi孢子悬浮液喷施于五爪金龙植株叶片上，每个叶片喷施量为2.5ml，将五爪金龙植株置于温度为25±5℃、相对湿度为85±5％的环境条件下2d；S2、免疫力衰落，等待3d；S3、施病菌致病，将浓度为2×10<supgt;6</supgt;个/ml的胶孢炭疽菌孢子悬浮液喷施于五爪金龙植株叶片上，每个叶片喷施量为2.5ml，等待2d。创建一种以低致病力胶孢炭疽菌作为五爪金龙生物防控菌的新技术，且无需使用化学杀菌剂即可削弱该植物免疫力的绿色新途径，通过削弱该植物的抗病性，再利用胶孢炭疽菌感染免疫力衰弱后的五爪金龙植株。技术研发人员：许华,周立颖,王莉兴,饶申受保护的技术使用者：武汉轻工大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13