一种副干酪乳酪杆菌后生元在龋齿防治中的应用

本发明涉及生物，具体涉及一种副干酪乳酪杆菌后生元防治龋齿的应用。

背景技术：

1、龋齿影响的人群广泛，其发生发展与致龋菌紧密相关。人类口腔中包含细菌、真菌、病毒等多种微生物，现有研究表明，变形链球菌(streptococcus mutans)与龋齿的形成有密切关系。龋齿表面的生物膜是一种以变形链球菌为核心，其他细菌形成外层的三维球形结构。该局部区域形成酸性ph环境，导致严重的牙釉质脱矿。与其他原始定植菌相比，变形链球菌通过形成致密的生物膜及其特有的毒力因子表现出更强的优势。在群体感应系统的调控下，变形链球菌最终成为主要的致龋细菌之一。随着龋齿的进展，口腔菌群的多样性变得局限，这种微生物失衡最终导致了龋齿的发生和发展。

2、针对性抑制口腔中变形链球菌的活力或毒力因子是防治龋齿的有效策略。目前对龋齿的防治主要是通过对口腔微生物进行杀灭，从而起到预防龋齿的作用，预防措施包括物理清除、化学抑制和生物干预。近年来，生物干预领域发展出一些新的策略，包括使用变形链球菌蛋白的特异性抑制剂、疫苗接种和具有中和细菌的被动免疫策略。虽然已经出现了一些创新的生物干预策略，但益生菌及其相关微生物制剂的使用是生物干预中更成熟的方法。

3、现有技术方案：

4、物理清除：

5、如刷牙或使用牙间隙清洁工具等清除口腔中的微生物和生物膜。

6、物理清除可能会损伤牙釉质引起牙齿敏感；需要较频繁和彻底的清洁；需要较高的依从性。

7、化学抑制：

8、漱口水、牙膏等产品通过添加西吡氯铵(cpc)等抑菌物质对口腔中的微生物进行杀灭。西吡氯铵是一种表面活性剂，能降低细胞表面张力，从而杀灭微生物。

9、化学物质抑制细菌是广谱杀菌的过程，可能会打破口腔微生物的平衡，造成口腔菌群紊乱；有些化学物质的药物毒副作用可能对人体健康影响较大；长期使用可能导致细菌产生抗药性。

10、生物干预：

11、多种益生菌的组合对变形链球菌等致龋菌的抑制作用。

12、现有生物干预的生物活性物质的稳定性一般较差，开发的产品类型受限；足够剂量的活微生物是益生菌给药的关键，但这对于免疫抵抗能力低的人来说是一种潜在风险。

13、生物干预通常使用益生菌，现如今在口腔健康方面的研究也表明益生菌可以有效预防各种口腔疾病，如龋齿、口腔黏膜炎和口臭。其中，副干酪乳酪杆菌具有显著防治龋齿的效果，其可能是产生抑菌物质发挥抑菌作用；此外，菌体本身与病原体之间的共聚集可能干扰病原菌形成生物膜。然而益生菌在生长繁殖的过程中可能也会促进龋齿的发展，而益生菌产生的后生元则能一定程度上避免这种风险。

14、后生元是指对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分，最常见的类型就是灭活菌体和无细胞上清液。相较于活益生菌，后生元具有低风险、载体选择多、易于制备和储存等优点。后生元是多种成分的混合物，其中细菌素、有机酸、生物表面活性剂等物质是潜在的有效抑菌物质，其可通过多种机制对口腔产生健康影响，这些机制可能是独立的，也可能是协同的。

15、目前，在国内外关于副干酪乳酪杆菌的研究中，尽管有一些应用到人体和实验动物的相关研究表现出较好的抑菌效果，但由于没有深入挖掘其在防治龋齿中的机制，特别是对变形链球菌的抑菌机制，因此无法开发出更有针对性的龋齿防治产品。

技术实现思路

1、本发明基于变形链球菌的致龋机制，首先研究副干酪乳酪杆菌后生元对变形链球菌菌体和生物膜增殖、形态、菌株特性的影响规律；接着评估后生元有效抑菌物质及应用的稳定性，最后通过体外生物膜模型研究后生元对变形链球菌的抑菌机制。该技术是在微生物用于疾病防治的领域中，应用副干酪乳酪杆菌后生元预防龋齿。

2、采用如下技术方案：

3、一种副干酪乳酪杆菌后生元的应用，用于抑制变形链球菌。

4、优选的，用于破坏变形链球菌的表面结构。

5、优选的，所述破坏变形链球菌的表面结构包括表面粗糙化、细胞膜去极化并增强通透性、降低疏水性中的一种或多种。

6、优选的，用于破坏变形链球菌形成的生物膜。

7、优选的，所述破坏变形链球菌形成的生物膜包括降低生物膜生物量、抑制生物膜形成、缩短生物膜菌体链长中的一种或多种。

8、优选的，用于抑制变形链球菌的毒力因子、群体感应相关基因中的一种或多种的表达。

9、优选的，所述毒力因子包括gbpa、gtfc、ldh、atpd中的一种或多种；所述群体感应相关基因包括vick。

10、本发明从菌体和生物膜两个角度出发，揭示副干酪乳酪杆菌后生元对变形链球菌的抑菌机制；基于变形链球菌的致病机制，结合其毒力因子和群体感应效应，深入探究副干酪乳酪杆菌后生元对变形链球菌的抑制机制。

11、优选的，所述副干酪乳酪杆菌后生元包括无细胞上清液。

12、后生元常见的类型是cfs(无细胞上清液)和灭活菌体，研究者们常选用cfs形式的后生元探究抑制病原体的机制。一方面是细菌素、有机酸、生物表面活性剂等有抑菌活性的细菌代谢产物常常被分泌到细胞外；另一方面，在体外抑菌实验中，灭活的益生菌与致病菌难以分辨，可选的评估抑菌效果的方法较少。综上，本发明选用cfs形式的后生元探究其对变形链球菌的抑菌机制。

13、本发明使用副干酪乳酪杆菌后生元抑制变形链球菌，其特征在于使用发酵上清液，而非直接使用活菌，后生元的来源是副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillusparacasei)。

14、本发明制备后生元的条件为，将副干酪乳酪杆菌传代菌液，按5％(v/v)接种于大体积发酵的mrs液体培养基中，37℃静置培养24h(充分发酵以收获产物)，菌液od600值约为1.9～2.1。将发酵菌液6000rpm离心7min，取上清液，其ph在4.00±0.20之间。

15、一种上述副干酪乳酪杆菌后生元的应用获得的制剂。

16、一种上述制剂的应用，用于制备防治龋齿的制剂。

17、优选的，用于制备减少钙流失的制剂。

18、本发明强调副干酪乳酪杆菌后生元在防治龋齿当中的应用。

19、本发明设计了一种体外验证后生元防治龋齿的模型。

20、与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：

21、与物理清除与化学抑制相比，生物干预具有针对性和友好性，但直接应用活菌仍有一定风险，而无生命的后生元具有更多优势和更大的潜力。本发明旨在探究副干酪乳酪杆菌后生元对游离和生物膜形式的变形链球菌的抑制效果,通过体外模型和qpcr阐明其抑菌机制，为开发生物友好型的防治龋齿的后生元产品奠定坚实的理论基础。

22、后生元能避免活菌的给药方式可能导致的菌血症等风险。本发明采用的后生元来源于副干酪乳酪杆菌，目前在国内外研究中，研究人员发现副干酪乳酪杆菌有较强抑菌作用。没有生命形式的后生元能有效避免传播抗生素抗性基因或打破原有口腔菌群平衡的风险；

23、本发明制备条件简单，将副干酪乳酪杆菌接种于液体培养基中培养24h，离心收获上清后用滤膜过滤，得到无细胞上清液即为本发明使用的副干酪乳酪杆菌后生元，可在短时间内大量获得后生元，本发明作用效果明显，对变形链球菌有显著抑制作用。