一种基于reads特征评估肿瘤来源的方法与流程

本发明属于肿瘤细胞识别，具体来说，涉及一种基于reads特征评估肿瘤来源的方法。

背景技术：

1、人体降解的dna片段通过细胞凋亡、坏死或细胞主动分泌释放到血液中，可作为细胞游离dna(cfdna)进行检测。循环肿瘤dna(ctdna)是指实体肿瘤细胞内的dna经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统的游离dna片段，是一种特征性的肿瘤生物标记。临床研究表明，ctdna浓度与肿瘤负荷成正比。cfdna的半衰期低于1个小时，通过ctdna的检测可实时有效监测肿瘤进展。已有研究证明ctdna检测相较于影像学能够提前1个月到半年提示肿瘤的复发。采用基于ctdna的液体活检可有效检测肿瘤复发，并在新辅助治疗疗效预测，辅助治疗疗效预测，免疫治疗疗效监测，晚期患者的系统治疗疗效监测，药物假期提示等方面具有探索，并表现出良好的应用前景。

2、mrd是指实体肿瘤经过根治性后依旧残留在体内不可见的分子残留病灶(molecular residue disease)，这些病灶通过影像学无法检测，但依然导致肿瘤复发或转移。ngs(二代测序技术)可以快速，高通量的检测患者体内残留的微量或不可见的肿瘤循环dna(ctdna)，检测类型包括突变检测，甲基化检测，片段组学检测。其中突变检测可以检测单碱基替换，缺失和插入等，不仅可以提示患者的mrd状态，并且可为患者监控肿瘤进展的新发突变。

3、但是在mrd肿瘤负荷较低的临床环境中，ctdna仅占cfdna的一小部分，通常小于0.1％。目前ngs测序方法的错误率在万分之一左右，因此在ctdna应用中准确区分错误与真实突变是非常重要的。为了增加mrd检测的敏感性，可以通过增加测序深度提高mrd的敏感性，但是随着测序深度的增加，会检出更多的假阳性位点。为了提高mrd检测的敏感性和特异性，需要通过实验技术和生信算法改进mrd检测性能。

4、集成数字错误抑制(ides)是华盛顿大学医学院aaron m newman等人发明的一种基于肿瘤不知情(tumor-agnostic assays)策略进行癌症个性化分析的方法，用于检测ctdna。该方法结合分子标签技术和基于健康人背景噪音的抛光(polish)策略，在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)患者水平达到92％的敏感性和>99％的特异性。但是该方法需要较多的健康人构建背景噪音数据库，增加了策略的应用成本，并且只可以应用于肿瘤不知情策略，不适用固定化面板(fixed-panel)以外的个性化追踪位点，无法准确的判断变异是否为真实的体细胞突变。分子残留病灶检测(mrdetect)技术是纽约基因组中心asafzviran等人实现的通过全基因组测序(wgs)定量cfdna肿瘤负荷，该算法提取追踪位点的突变reads特征，包括变异碱基质量，read平均质量、read方向、read正负链、突变位置和比对质量，使用支持向量机(svm)机器学习方法抑制测序错误，该方法未使用突变背景，片段信息，分子标签信息等特征，无法在单个突变水平定性mrd状态。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于reads特征评估肿瘤来源的方法，抑制pcr扩增和测序过程中产生的背景错误，发现cfdna中真实的肿瘤突变。

2、为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种基于reads特征评估肿瘤来源的方法，包括步骤：

4、s1、阳性ctdna突变集筛选和阴性cfdna突变集筛选；

5、s2、根据基因组fasta文件和比对bam文件进行特征提取；

6、s3、将阳性集和阴性集reads做好肿瘤与非肿瘤标签，将数据集随机分成n份；

7、s4、基于多个机器学习模型算法构建分类模型，并通过5折交叉验证方法进行模型准确性及稳定性评估，筛选最优模型；

8、s5、利用网格搜索方法找到模型最优参数组合，并进行模型性能测试；

9、s6、将reads回溯至位点水平，单个位点的肿瘤概率为该位点所有reads肿瘤概率的平均值，进行模型性能测试。

10、进一步地，阳性ctdna突变集筛选包括：ctdna突变和背景噪音及其他突变；从cfdna突变图谱中筛选ctdna突变，挑选位点深度≥500，突变深度≥3，vaf(变异等位基因分数)>0.003，等突变位点，共计筛选500个ctdna突变位点，共计约5000条reads作为阳性集。

11、进一步地，阴性突变集筛选：去除胚系突变后，vaf(变异等位基因分数)<0.02，位点深度≥500，从10例健康人筛选出30000条reads；随机挑选5000条reads作为阴性集。

12、进一步地，步骤s2中所提取的特征包括：

13、单碱基突变类型(g>a)：单碱基突变；

14、三碱基突变类型(tg>ac)：单碱基突变，包括突变两侧的碱基；

15、突变位置的基因组背景：突变两侧5bp参考碱基和突变碱基的基因组序列占比；insert size：read1和read2之间插入片段的长度；

16、read：突变发生在read1或read2；

17、orient：突变比对到基因组正链或负链；

18、position：突变位置距离read 5’端的距离；

19、duplex read：是否为dcs(双端一致性序列)reads；

20、base质量：包括突变碱基质量、突变两侧2bp、3bp、5bp、整体read的平均碱基质量；

21、ad，cd：分子标签去重矫正前的reads数量；

22、ae，ce：分子标签去重矫正前的碱基错误率。

23、进一步地，测序数据获得：

24、肿瘤患者组织样本及白细胞对照处理：

25、组织样本和对照样本基因组dna进行超声打碎，建成gdna文库；将dna文库分别与内部1123panel(2m大小)进行杂交，将基因组dna目标区域捕获下来；回收目标dna片段，构建高通量测序文库。

26、肿瘤患者和健康人cfdna样本处理：

27、根据组织生信分析结果生成患者个性化突变图谱，合成个性化探针，加入内部200kpanel探针，共同用于cfdna捕获(健康人只使用200k panel)；将以上探针与cfdna进行杂交；回收目标cfdna，构建高通量测序文库。

28、进一步地，生信处理：

29、肿瘤患者组织样本及白细胞对照处理：

30、获取fastq文件：在高通量测序仪(mgi2000)上完成测序，测序平台将得到的光信号转化为bcl格式的测序下机数据，并对下机数据进行拆分，根据样本index将单个样本的测序数据拆分出来，转换成fastq格式。

31、获取高质量bam文件：将第一步获取的fastq文件进行数据质控，通过数据质控去除测序低质量的序列；利用基因组bwa比对软件进行比对，获取bam文件，使用samtools去除冗余，得到去冗余的bam文件；使用samtools过滤mapq值低于30的序列生成高质量的去冗余bam文件，之后使用gatk对bam文件进行矫正，获得矫正之后的bam文件。

32、获取肿瘤变异检测vcf文件和注释文件：通过变异检测软件gatk，检测肿瘤突变，得到vcf文件，使用anovar，snpeff软件对突变位点注释，注释内容包括，突变类型，人群频率，cosmic数据库记录。

33、获取患者个性化肿瘤突变集，筛选条件：去除胚系突变，位点质控合格，组织位点深度>50，突变深度>8，人群频率<0.002，非链特异性。

34、肿瘤患者和健康人cfdna样本处理：

35、获取fastq文件：在高通量测序仪(mgi2000)上完成测序，测序平台将得到的光信号转化为bcl格式的测序下机数据，并对下机数据进行拆分，根据样本index将单个样本的测序数据拆分出来，转换成fastq格式。

36、获取高质量bam文件：将第一步获取的fastq文件进行数据质控，通过数据质控去除测序低质量的序列；利用fgbio软件提取umi序列，并添加至umi.ubam文件；将umi.ubam文件转为fastq文件，利用基因组bwa比对软件进行比对，获得umi.bam文件；使用picard软件，合并umi.ubam和umi.bam文件，或者umi.merge.bam文件；通过fgbio软件进行umi矫正，对umi序列一致的reads进行去重矫正，获得双端(dcs)和单端一致性序列(scs)。

37、获取肿瘤变异检测vcf文件和注释文件：通过变异检测软件gatk，检测肿瘤突变，得到vcf文件，使用anovar，snpeff软件对突变位点注释，注释内容包括，突变类型，人群频率，cosmic数据库记录。

38、本发明相比现有技术，具有如下有益效果：

39、突变背景特征，reads特征的，片段特征的选择；提取特征来源数据包括但不限于panel，wes，wgs等二代测序方法；该算法适用于tumor-informed策略和策略；ctdna突变集来源于自有的突变图谱数据库。降低背景噪音的构建成本，该方法有很好的鲁棒性。