一种双佐剂红鳍东方鲀来源哈维氏弧菌灭活疫苗及应用

本发明属于生物工程，涉及一种双佐剂红鳍东方鲀来源哈维氏弧菌灭活疫苗及应用。

背景技术：

1、红鳍东方鲀(takifugu rubripes)俗称河鲀，是一种重要的经济鱼类。近年来，随着国内市场的有条件开放，红鳍东方鲀养殖产业快速发展。然而，以哈维氏弧菌为主要病原的细菌性疫病也随之频繁爆发，严重制约产业的绿色可持续发展，其病害问题亟待破解。病害发生后，生产企业通常通过大规模、多种类抗生素类药物联合使用控制感染。但抗生素滥用亦引发耐药菌株出现，造成环境污染甚至危害人类健康。疫苗接种逐步成为鱼类病害防控的优势方案。目前，我国鱼用疫苗相关研究已逐步展开，但尚无针对红鳍东方鲀细菌性疫病的特异性疫苗，相关安全高效的特异性疫苗研发已迫在眉睫。

2、目前鱼用疫苗根据抗原类别主要包括灭活疫苗、减毒/弱毒活疫苗、亚单位/合成肽疫苗和dna疫苗等。其中，灭活疫苗具有生产工艺简单、易于生产保存以及无毒力返祖问题等诸多优势，因而被广泛研究。疫苗研制过程中，除使用特异性抗原外，佐剂的选择也是至关重要的。常见佐剂包括铝盐类、白油类、维生素以及中药多糖等。明矾佐剂是一种由氢氧化铝和氢氧化镁混合的商品化制剂，与白油类佐剂相比，明矾佐剂易与抗原混合，无需乳化过程、操作简单，与抗原混合使用可有效刺激机体产生高水平抗体。但明矾佐剂主要激活机体内体液免疫和th2型细胞免疫应答。cpg脱氧核糖寡核甘酸(cpgoligodeoxynucleotides,cpg-odn)是一类未甲基化的含有基序的寡聚核苷酸序列，具有促进th1型细胞因子和促炎因子产生的活性。cpg-odn可通过黏膜进入体内，增强机体黏膜免疫应答水平，可作为有效的黏膜佐剂。因此针对不同病原和宿主的特征，优化不同佐剂配伍制备疫苗，能针对性的提高机体的免疫反应性，增强免疫保护效果。但相关研究在红鳍东方鲀细菌性疫病的防治中极为匮乏，亟待加强。

技术实现思路

1、本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，提供一种双佐剂红鳍东方鲀来源哈维氏弧菌灭活疫苗及应用。

2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

3、一种双佐剂红鳍东方鲀来源哈维氏弧菌灭活疫苗，包含抗原和佐剂，其中抗原为灭活哈维氏弧菌(2hwh008株)，佐剂为含cpg-odn重组质粒的商品化明矾。

4、所述抗原与佐剂按体积比为1:1的比例混合。

5、所述佐剂中cpg-odn重组质粒的浓度为20±2μg/ml。

6、一种灭活疫苗的制备方法：

7、1)抗原的制备：

8、将活化的哈维氏弧菌2hwh008株置于营养肉汤培养基中培养至对数培养期，而后通过甲醛溶液灭活离心收集沉淀，经无菌pbs重悬至细菌浓度为2×109～1×1010cfu/ml，待用；

9、所述活化的哈维氏弧菌2hwh008株为将哈维氏弧菌2hwh008株接种在tsa琼脂培养基上，28℃恒温培养24小时。

10、所述通过甲醛溶液灭活为当细菌进入对数生长期时，于菌液中加入终浓度为0.2％的甲醛溶液灭活细菌24小时，期间每隔6小时充分搅动1次菌液；将已灭活的菌液在4℃条件下以8000×g离心10分钟收集菌体沉淀，再用无菌pbs洗涤菌液3次，而后重悬至细菌浓度为2×109-1×1010cfu/ml，待用。

11、2)佐剂的制备：

12、采用细菌加热裂解法大规模制备cpg-odn重组质粒，而后加入至商品化明矾佐剂中，至其终浓度为20±2μg/ml；

13、所述cpg-odn重组质粒加入至商品化明矾佐剂中后振荡使cpg-odn重组质粒充分裂解并混入佐剂内。

14、3)灭活疫苗的制备：

15、将抗原和佐剂按体积比为1:1的比例混合。使用前将佐剂颠倒混匀，将等体积抗原缓慢滴加至佐剂内。制备成为灭活疫苗，待用。

16、一种灭活疫苗的应用，将该灭活疫苗注射红鳍东方鲀后，可诱导抗体大量产生并提高鱼体抗哈维氏弧菌感染的能力，所述灭活疫苗可用于预防红鳍东方鲀因哈维氏弧菌感染而引起的疾病。

17、所述疫苗采用肌肉注射方式接种至红鳍东方鲀背鳍基部，接种剂量为1×108cfu/尾。接种21天后，用哈维氏弧菌dlp1171株攻毒检测免疫保护效果，发现相对于pbs对照组，疫苗接种组死亡率降低，疫苗免疫保护效果显著，保护率达60％。证明接种灭活疫苗可增强红鳍东方鲀抵御哈维氏弧菌感染的能力，疫苗可有效保护养殖鱼类。

18、本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

19、本发明的灭活疫苗所使用的哈维氏弧菌2hwh008株分离自患病红鳍东方鲀，具有良好的免疫原性。本发明的灭活疫苗免疫接种可诱导红鳍东方鲀鱼体产生高水平抗体，从而有效对抗哈维氏弧菌的感染，免疫保护效率达到60％。此外，使用灭活疫苗单次免疫即可产生较好的保护效果，具有节约养殖成本、降低多次接种对红鳍东方鲀造成的损伤等优点。

20、根据本发明结果，建议养殖户可在疾病流行季节前7天-28天左右对红鳍东方鲀接种本疫苗，以达到有效预防感染和控制疾病发生的目的。

21、综上，本发明双佐剂哈维氏弧菌灭活疫苗的一次免疫接种，即可对红鳍东方鲀产生较强免疫保护效果，不仅操作过程简单，而且经济实用，在实际养殖过程中具有较高的应用价值和良好的发展前景。

技术特征：

1.一种双佐剂红鳍东方鲀来源哈维氏弧菌灭活疫苗，其特征在于：灭活疫苗为抗原和佐剂，其中，抗原为哈维氏弧菌(2hwh008株)，佐剂为含cpg-odn重组质粒的商品化明矾。

2.按权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于：所述抗原与佐剂按体积比为1:1的比例混合。

3.按权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于：所述佐剂中cpg-odn重组质粒的浓度为20±2μg/ml。

4.一种权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

5.按权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述活化的哈维氏弧菌2hwh008株为将哈维氏弧菌2hwh008株接种在tsa琼脂培养基上，28℃恒温培养24小时。

6.按权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述通过甲醛溶液灭活为当细菌进入对数生长期时，于菌液中加入终浓度为0.2％的甲醛溶液灭活细菌24小时，期间每隔6小时充分搅动1次菌液；将已灭活的菌液在4℃条件下以8000×g离心10分钟收集菌体沉淀，再用无菌pbs洗涤菌液3次，而后重悬至细菌浓度为2×109～1×1010cfu/ml，待用。

7.按权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述cpg-odn重组质粒加入至商品化明矾佐剂中后振荡使cpg-odn重组质粒充分裂解并混入佐剂内。

8.一种权利要求1所述的灭活疫苗的应用，其特征在于：所述灭活疫苗可用于预防红鳍东方鲀因哈维氏弧菌感染而引起的疾病。

9.按权利要求8所述的应用，其特征在于：所述疫苗接种至红鳍东方鲀背鳍基部，接种剂量为1×108cfu/尾。

技术总结本发明属于生物工程技术领域，涉及一种双佐剂红鳍东方鲀来源哈维氏弧菌灭活疫苗及应用。双佐剂红鳍东方鲀来源哈维氏弧菌灭活疫苗，包含抗原和佐剂，其中抗原为灭活哈维氏弧菌(2HWH008株)，佐剂为含CpG‑ODN重组质粒的商品化明矾。抗原与佐剂按体积比为1:1的比例混合。佐剂中CpG‑ODN重组质粒的浓度为20±2μg/mL。本发明的灭活疫苗所使用的哈维氏弧菌2HWH008株分离自患病红鳍东方鲀，具有良好的免疫原性。本发明的灭活疫苗免疫接种可诱导红鳍东方鲀鱼体产生高水平抗体，从而有效对抗哈维氏弧菌的感染，免疫保护效率达到60％。此外，使用灭活疫苗单次免疫即可产生较好的保护效果，具有节约养殖成本、降低多次接种对红鳍东方鲀造成的损伤等优点。技术研发人员：宋林生,于思淼,高磊,王伟林,王玲玲,叶仕根受保护的技术使用者：大连海洋大学技术研发日：技术公布日：2024/6/11