高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液及其制法的制作方法

本发明属于现代化学药物，具体涉及一种具有高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液及其制备方法。

背景技术：

1、儿童青少年总体近视率为52.7％，其中，6岁儿童为14.3％，小学生为35.6％，初中生为71.1％，高中生为80.5％，在我国青少年的近视情况十分严峻，儿童青少年近视的发生呈现“低龄、高发”趋势，对社会和家庭造成严重负担。2021年中华中医药学会眼科分会发布了《儿童青少年近视防控适宜技术指南》，指出“充分发挥中医药在儿童青少年近视防控中的作用”；2022年国家教育部办公厅印发了《全国综合防控儿童青少年近视重点工作计划》，旨在系统谋划的基础上扎实推进新形势下青少年儿童的近视防控工作。

2、如何对儿童青少年近视采取简单有效的控制方法是当务之急。硫酸阿托品是唯一经循证医学验证能有效控制近视进展的药物，硫酸阿托品能够控制近视轴向生长，从而控制近视度数增长，硫酸阿托品防控近视进展成为眼视光学中药物控制近视研究的热点。

3、硫酸阿托品被世界公认为有效缓解近视发展和控制眼轴生长的首选药物。一项涉及400名6～12岁亚洲儿童阿托品控制近视的5年临床研究(atropine for the treatmentof myopia，atom1)的随机对照试验发现，两年内1％阿托品滴眼液的近视进展和眼轴增长分别为(-0.28±0.92)d和(0.02±0.35)mm，而安慰剂组为(-1.20±0.69)mm。阿托品治疗可使近视平均进展减少约77％。结果表明，与安慰剂相比，每晚点用1％阿托品滴眼液可减少儿童和青少年中低度近视的进展。gong,qianwen,liu,等发表的论文《therapeutic effectof atropine 1％ in children with low myopia》中显示，对相同浓度的阿托品治疗近视进行了研究，结果表明1％阿托品对预防和治疗儿童青少年近视有效。随后，audrey,chia,wei-han等进行了一项前瞻性随机双盲临床试验(atom2)，分别给予近视儿童双眼每晚一次，规律点0.5％、0.1％和0.01％阿托品眼液。结果显示，0.5％、0.1％和0.01％阿托品组两年平均近视进展为(-0.30±0.60)、(-0.38±0.60)、(-0.49±0.63)d，眼轴长度平均增加分别为(0.27±0.25)、(0.28±0.28)、(0.41±0.32)mm，与atom1安慰剂组结果相比，三种浓度的阿托品能有效减缓近视进展和眼轴生长，该研究成果在论文《atropine for thetreatment of childhood myopia:safety and efficacy of 0.5％,0.1％,and 0.01％doses(atropine for the treatment of myopia 2)》中公开发表。其他临床研究也证实了上述研究结果。

4、以上临床试验证明，高浓度(1％、0.5％、0.1％)阿托品和低浓度(0.05％、0.02％、0.01％)阿托品均能有效控制近视屈光度和眼轴增长。然而，阿托品控制近视的有效浓度仍不清楚。因此，yam等进行了一项随机对照双盲试验(lamp1)。1年后0.05％、0.025％和0.01％阿托品组和安慰剂组的se变化分别为(-0.27±0.61)、(-0.46±0.45)、(-0.59±0.61)、(-0.81±0.53)d(p<0.001)，眼轴的平均增长(0.20±0.25)、(0.29±0.20)、(0.36±0.29)和(0.41±0.22)mm(p<0.001)，结果表明低浓度(0.05％、0.02％、0.01％)阿托品滴眼液均可减缓近视的发展，且在三种浓度中，0.05％阿托品效果最明显，该研究成果在论文《low-concentration atropine for myopia progression(lamp)study:arandomized,double-blinded,placebo-controlled trial of 0.05％,0.025％,and 0.01％ atropineeye drops in myopia control》中公开发表。yam j c,li f f,zhang x等研究人员在lamp2研究的第二阶段中，发现0.05％阿托品在三种低浓度中疗效最好，进一步证明阿托品在控制近视进展方面具有剂量依赖性作用，即阿托品浓度越高，减缓近视进展的疗效越好，该研究成果在论文《two-year clinical trial of the low-concentration atropinefor myopia progression(lamp)study:phase 2report》中公开发表。

5、在atom2和lamp2研究中，所有浓度的阿托品眼液均具有良好的耐受性，对生活质量无明显不良影响。符爱存等研究认为阿托品滴眼液对眼压无明显影响。chia a,li w,tand等发现没有证据证实每天使用阿托品会造成视网膜损伤。从以往的临床试验来看，阿托品滴眼液的主要副作用是括约肌麻痹后瞳孔扩大引起的畏光和视物模糊，尤其是在使用高浓度阿托品眼液的情况下。另外，停用阿托品眼液后会发生有近视回退。suffee bibishaminah,shipkolye mohammad ashiff,吕帆等科研人员发现，阿托品停药后近视回退进展缓慢，而低浓度的阿托品回退最小，不良反应较少。大量数据表明阿托品滴眼液在有效性和副作用方面都遵循剂量依赖效应。

6、0.01％阿托品越来越广泛用于治疗青少年近视。在阿托品控制近视的5年临床研究(atropine for the treatment of myopia，atom)中，与atom1研究中的0.50％浓度阿托品相比，0.01％浓度阿托品在2年的治疗中，近视进展减缓率为59％，副作用最小。在低浓度阿托品治疗近视进展研究中，尽管0.01％与0.025％和0.05％阿托品相比疗效较差，但差异不明显，且0.01％的阿托品延缓近视发展更优，在治疗后1年和2年近视进展分别减少27.0％和27.7％。这些研究均证明了0.01％阿托品治疗儿童近视的疗效。

7、低浓度硫酸阿托品滴眼液预防近视优势明显，具有广阔的市场前景。20世纪70年代起，多项临床研究结果表明1％的阿托品能够有效延缓近视发展，但可能会出现瞳孔散大、畏光、视近模糊、过敏性结膜炎、过敏性睑缘炎等明显的不良不应。随着科学研究的推进，临床上已经证明0.01％的低浓度阿托品同样能有效防控青少年近视，且副作用较小，是目前已知防控青少年近视效果最佳手段。

8、阿托品在中性环境下，每季度会降解5～7％，降解产物具有神经毒性，这种药理学上的不稳定性使其很难全面商业化。

9、纳米基质是由明胶和透明质酸通过高压纳米制备方法，将明胶和透明质酸的原物理空间结构打开，降低分子量并进行分子空间构型重排，形成新的氢键、疏水键等非共价键，形成新的高分子材料，从而使该纳米基质具有载药能力，由于该材料通过空间重构，具备新的理化性质，能够与细胞膜极性相似，从而更容易穿透细胞膜，进入细胞内部，使其所携带活性化合物及时发挥作用。

10、明胶(gelatin)是由动物皮肤、骨、肌膜、肌魅等结缔组织中的胶原部分降解而成，由18种氨基酸组成，其中脯氨酸(pro)和羟脯氨酸(hyp)的含量较高。明胶的分子结构式，见如下式(1)：

11、

12、明胶溶液可形成具有一定硬度、不能流动的凝胶。当明胶凝胶受到环境刺激时会随之响应，即当溶液的组成、ph值、离子强度发生变化和温度、光强度、电场等刺激信号发生变化时，或受到特异的化学物质刺激时，凝胶就会发生突变，呈现出相转变行为。

13、透明质酸是由单位d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，透明质酸分子结构式，见如下式(2)：

14、

15、透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。

16、纳米技术，也称毫微技术，是研究结构尺寸在1纳米至100纳米范围内材料的性质和应用的一种技术。纳米颗粒的尺寸可以影响细胞受体和药物之间熵和焓的热力学特性，进而对它们之间粘附力有一定的影响，纳米颗粒还可以通过被动渗透的方式进入细胞。

17、纳米基质，利用多糖与蛋白质化学结构特点，他们之间易于产生氢键、疏水键等非共价键，将多糖与蛋白质空间构型进行重排，形成新的高分子化合物。

18、透明质酸在3400cm-1处的o-h伸缩振动峰，明胶在3432cm-1处的n-h伸缩振动吸收峰出现了向低波段的偏移，同时强度显著增强，表明纳米基质的多糖蛋白产生了氢键；2800cm-1附近的特征峰基本没有变化，明胶在1673cm-1处的酰胺ⅰ带吸收峰以及透明质酸在1665cm-1处的羧基振动吸收峰向低波段移动并减弱，说明纳米基质中存在着明显的氢键作用。

19、己知s＝o在1220cm-1处有明显的特征吸收峰，纳米基质的红外谱图中出现了明显的s＝o的特征吸收峰，且明胶中1580cm-1附近的n-h特征吸收峰减弱或消失，代表透明质酸、明胶中质子化后的nh3+与so42-发生了强烈的静电吸引作用。

20、通过红外分光光度法鉴定多糖与多肽之间有新氢键等非共价键形成，见附图1，从而导致其理化性质也随之发生变化，附图2为纳米基质的红外电镜谱图，微观结构已不同于明胶的红外电镜谱图(附图3)和透明质酸的红外电镜谱图(附图4)。

技术实现思路

1、本发明提供一种具有高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液。

2、本发明还提供了该高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液的制备方法。

3、本发明的技术方案是通过以下方式实现的：

4、一种具有高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液，是由明胶、透明质酸、硫酸阿托品和纯净水制备而成。

5、所述的具有高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液，是由明胶、透明质酸、硫酸阿托品和纯净水制备成硫酸阿托品浓度为0.01％、纳米基质浓度为0.5％的硫酸阿托品纳米基质滴眼液。

6、所述的具有高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液，是采用如下方法制备的：

7、a.0.5％的透明质酸水溶液的制备：取透明质酸，溶于纯净水中，待充分溶解后，制得0.5％的透明质酸水溶液；

8、b.蛋白多糖溶液的制备：称取明胶加入到步骤a制得的0.5％的透明质酸水溶液中，充分溶解，然后在紫外光线下，照射，进行交联化反应，制得蛋白多糖溶液；

9、c.蛋白多糖冻干粉的制备：将步骤b制得的蛋白多糖溶液放入冻存管中，放入冰箱中，预冻，然后再放入冷冻干燥机中，进行冷冻干燥，制得蛋白多糖冻干粉；

10、d.高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液的制备：取步骤c制得的蛋白多糖冻干粉与硫酸阿托品药物，进行混合，加入纯净水，搅拌均匀使其溶解，形成混合溶液；使用高压均质机对混合溶液进行高压均质法纳米化处理，制得硫酸阿托品浓度为0.01％、纳米基质浓度为0.5％的硫酸阿托品纳米基质滴眼液。

11、所述的高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液，优选是采用如下方法制备的：

12、a.0.5％的透明质酸水溶液的制备：按照透明质酸：纯净水的质量比0.5：100的比例，称取透明质酸，溶于纯净水中，待充分溶解后，制得0.5％的透明质酸水溶液；

13、b.蛋白多糖溶液的制备：按照明胶：透明质酸的质量比12：1的比例，称取明胶加入到步骤a制得的0.5％的透明质酸水溶液中，充分溶解，然后在紫外光线下，照射，进行交联化反应，制得蛋白多糖溶液；

14、c.蛋白多糖冻干粉的制备：将步骤b制得的蛋白多糖溶液放入冻存管中，放入冰箱中，在-20℃下预冻11～13h，然后再放入冷冻干燥机中，按照如下程序开机运行，程序：0℃下保持3～5h，然后-20℃下保持3～5h，然后-40℃下保持7～9h，然后-20℃下保持2～4h，然后-10℃下保持2～4h，然后0℃下保持2～4h，最后10℃下保持2～4h，制得蛋白多糖冻干粉；

15、d.高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液的制备：按照蛋白多糖冻干粉：硫酸阿托品的质量比50:1的比例，取步骤c制得的蛋白多糖冻干粉与硫酸阿托品药物，进行混合，加入纯净水，搅拌均匀使其溶解，形成混合溶液；使用高压均质机对混合溶液进行高压均质法纳米化处理，压力参数为700～900pa，进行循环处理，每次15～25分钟，制得硫酸阿托品浓度为0.01％、纳米基质浓度为0.5％的硫酸阿托品纳米基质滴眼液。

16、所述的高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液，更为优选是采用如下方法制备的：

17、a.0.5％的透明质酸水溶液的制备：按照透明质酸：纯净水的质量比0.5：100的比例，称取0.5重量份透明质酸，溶于100重量份纯净水中，待充分溶解后，制得0.5％的透明质酸水溶液，待用；

18、b.蛋白多糖溶液的制备：按照明胶：透明质酸的质量比12：1的比例，称取6重量份的明胶加入到步骤a制得的0.5％的透明质酸水溶液100重量份中，充分溶解，然后在5w/cm2紫外光线下，照射30分钟，进行交联化反应，制得蛋白多糖溶液；

19、c.蛋白多糖冻干粉的制备：将步骤b制得的蛋白多糖溶液放入冻存管中，放入冰箱中，在-20℃下预冻12h，然后再放入冷冻干燥机中，按照如下程序开机运行，程序：0℃下保持4h，然后-20℃下保持4h，然后-40℃下保持8h，然后-20℃下保持3h，然后-10℃下保持3h，然后0℃下保持3h，最后10℃下保持3h，制得蛋白多糖冻干粉；

20、d.高渗透性能的低浓度硫酸阿托品纳米基质滴眼液的制备：按照蛋白多糖冻干粉：硫酸阿托品的质量比50:1的比例，取步骤c制得的蛋白多糖冻干粉50重量份与硫酸阿托品药物1重量份，进行混合，加入纯净水至10000重量份，搅拌均匀使其溶解，形成混合溶液；使用高压均质机对混合溶液进行高压均质法纳米化处理，压力参数为800pa，进行3次循环处理，每次20分钟，制得硫酸阿托品浓度为0.01％、纳米基质浓度为0.5％的硫酸阿托品纳米基质滴眼液。

21、本技术文件中涉及的浓度均为质量浓度。

22、纳米基质浓度＝蛋白多糖冻干粉的质量/溶液的质量。

23、通过以下的实验1和实验2来证明本技术提出的技术方案的技术效果。

24、实验1：硫酸阿托品检测方法的适用性验证实验

25、目的：对硫酸阿托品的检测方法进行适用性验证，确认该检测方法适用于产品标志性成分的含量测定，并以此方法测定透皮吸收、透粘膜吸收样品含量。参照《中国药典》2020年版二部“硫酸阿托品眼膏”项下含量测定方法，对硫酸阿托品的含量进行检测。

26、1.1方法

27、1.1.1仪器

28、岛津lc-20at高效液相色谱仪、dad检测器、电子天平ab135-s。

29、1.1.2试剂

30、乙腈(色谱纯，迪马科技有限公司)、水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)、磷酸二氢钾(天津市风船化学试剂科技有限公司)、庚烷磺酸钠(上海麦克林生化科技有限公司)、硫酸阿托品对照品(北京中检航标计量技术有限公司，批号：drk-1966-980310，纯度>98％)。

31、1.1.3色谱条件

32、色谱柱：agilent eclipse plus c18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；

33、流动相：0.05mol/l磷酸二氢钾溶液(含0.0025mol/l庚烷磺酸钠)-乙腈(84∶16)；

34、检测波长：225nm；

35、柱温：30℃

36、进样体积20μl。

37、1.1.4对照品溶液的制备

38、硫酸阿托品储备液(0.18mg/ml)：取硫酸阿托品对照品9.3mg，精密称定，加水溶解并定量至50ml量瓶中，制成每1ml中含0.18mg的溶液，作为硫酸阿托品储备液。

39、硫酸阿托品使用液(9.11μg/ml)：精密量取硫酸阿托品储备液(0.18mg/ml)2.5ml，加水溶解并定量至50ml量瓶中，制成每1ml中含9.11μg的溶液，作为硫酸阿托品使用液。

40、1.1.5供试品溶液的制备

41、取样品溶液，精密量取0.1ml置于2ml ep管中，加流动相稀释至1ml，过0.45μm微孔滤膜，既得。

42、1.1.6测定

43、精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，按本实验“1.1.3”所述条件测定并记录色谱图。按外标法以峰面积计算。

44、1.2分析方法验证

45、1.2.1线性和范围

46、按照“1.1”的方法实验，吸取硫酸阿托品使用液(9.11μg/ml)5、10、15、20、40、60、80μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以含量(x，μg)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。

47、硫酸阿托品：y＝311064.3228x－3031.9650r＝0.9999。

48、结果表明硫酸阿托品在0.05μg～0.73μg范围内线性良好，结果见表1和附图5。

49、表1硫酸阿托品标准曲线数据

50、

51、1.2.2精密度

52、精密吸取硫酸阿托品使用液(9.11μg/ml)20μl，按本实验上述“1.1.6”中的方法测定，记录色谱图，连续进样6次，使用液中硫酸阿托品峰面积值的rsd为1.90％，表明精密度试验符合要求。结果见表2。

53、表2硫酸阿托品精密度测定结果

54、

55、1.2.3稳定性

56、精密吸取同一份供试品溶液20μl，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样，按“1.1.6”方法测定，24h内硫酸阿托品含量的rsd为1.59％，结果表明供试品溶液在24h内稳定，结果见表3。

57、表3硫酸阿托品稳定性测定结果

58、

59、1.2.4重复性

60、按照“1.1.5”制备供试品溶液6份，按“1.1.6”法测定，记录色谱图。硫酸阿托品含量平均值为95.16μg，rsd为1.69％，符合要求，结果见表4。

61、表4硫酸阿托品重复性测定结果

62、

63、1.2.5回收率

64、低浓度回收率测定(80％)：取样品溶液，精密量取0.05ml，置于2ml ep管中，精密加入“1.1.4”硫酸阿托品使用液(9.11μg/ml)0.4ml，加流动相稀释至1ml，过0.45μm微孔滤膜，按“1.1.6”法测定，记录色谱图，计算，制得(3份)。

65、中浓度回收率测定(100％)：取样品溶液，精密量取0.05ml，置于2ml ep管中，精密加入“1.1.4”硫酸阿托品使用液(9.11μg/ml)0.5ml，加流动相稀释至1ml，过0.45μm微孔滤膜，按“1.1.6”法测定，记录色谱图，计算，即得(3份)。

66、高浓度回收率测定(120％)：取样品溶液，精密量取0.05ml，置于2ml ep管中，精密加入“1.1.4”硫酸阿托品使用液(9.11μg/ml)0.6ml，加流动相稀释至1ml，过0.45μm微孔滤膜，按“1.1.6”法测定，记录色谱图，计算，即得(3份)。

67、结果见表5，平均回收率为101.64％，rsd为1.76％，符合要求。

68、表5硫酸阿托品回收率测定结果

69、

70、1.3结论

71、综上所述，本方法适用于测定硫酸阿托品的含量。

72、实验2：不同浓度纳米硫酸阿托品滴眼液透皮吸收效果实验

73、目的：通过体外透皮给药实验方法和体外透黏膜给药实验方法，研究不同浓度纳米硫酸阿托品滴眼液的透皮吸收效果。

74、1 方法

75、1.1 仪器

76、岛津lc-20at高效液相色谱仪、dad检测器、电子天平ab135-s、改良franz扩散池。

77、1.2试剂

78、乙腈(色谱纯，迪马科技有限公司)、水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)、磷酸二氢钾(天津市风船化学试剂科技有限公司)、庚烷磺酸钠(上海麦克林生化科技有限公司)、硫酸阿托品对照品(北京中检航标计量技术有限公司，批号：drk-1966-980310，纯度>98％)。

79、1号样品：空白组，生理盐水。

80、2号样品(非纳米基质)：阳性药物，0.01％硫酸阿托品滴眼液，批号：20230511，包头朝聚眼科医院。

81、3号样品(低浓度纳米基质)：0.01％硫酸阿托品低浓度纳米基质滴眼液。

82、制备方法如下：

83、a.0.1％的透明质酸水溶液的制备：按照透明质酸：纯净水的质量比0.1：100的比例，称取0.1g透明质酸，溶于100g纯净水中，待充分溶解后，制得0.1％的透明质酸水溶液，待用；

84、b.蛋白多糖溶液的制备：按照明胶：透明质酸的质量比12：1的比例，称取1.2g的明胶加入到步骤a制得的0.1％的透明质酸水溶液100g中，充分溶解，然后在5w/cm2紫外光线下，照射30分钟，进行交联化反应，制得蛋白多糖溶液；

85、c.蛋白多糖冻干粉的制备：将步骤b制得的蛋白多糖溶液放入冻存管中，放入冰箱中，在-20℃下预冻12h，然后再放入冷冻干燥机中，按照如下程序开机运行，程序：0℃下保持4h，然后-20℃下保持4h，然后-40℃下保持8h，然后-20℃下保持3h，然后-10℃下保持3h，然后0℃下保持3h，最后10℃下保持3h，制得蛋白多糖冻干粉；

86、d.0.01％硫酸阿托品低浓度纳米基质滴眼液的制备：按照蛋白多糖冻干粉：硫酸阿托品的质量比10:1的比例，取步骤c制得的蛋白多糖冻干粉10g与硫酸阿托品药物1g，进行混合，加入纯净水至10000g，搅拌均匀使其溶解，形成混合溶液；使用高压均质机对混合溶液进行高压均质法纳米化处理，压力参数为800pa，进行3次循环处理，每次20分钟，制得硫酸阿托品浓度为0.01％、纳米基质浓度为0.1％的硫酸阿托品纳米基质滴眼液。

87、4号样品(中浓度纳米基质)：0.01％硫酸阿托品中浓度纳米基质滴眼液。

88、制备方法如下：

89、a.0.5％的透明质酸水溶液的制备：按照透明质酸：纯净水的质量比0.5：100的比例，称取0.5g透明质酸，溶于100g纯净水中，待充分溶解后，制得0.5％的透明质酸水溶液，待用；

90、b.蛋白多糖溶液的制备：按照明胶：透明质酸的质量比12：1的比例，称取6g的明胶加入到步骤a制得的0.5％的透明质酸水溶液100g中，充分溶解，然后在5w/cm2紫外光线下，照射30分钟，进行交联化反应，制得蛋白多糖溶液；

91、c.蛋白多糖冻干粉的制备：将步骤b制得的蛋白多糖溶液放入冻存管中，放入冰箱中，在-20℃下预冻12h，然后再放入冷冻干燥机中，按照如下程序开机运行，程序：0℃下保持4h，然后-20℃下保持4h，然后-40℃下保持8h，然后-20℃下保持3h，然后-10℃下保持3h，然后0℃下保持3h，最后10℃下保持3h，制得蛋白多糖冻干粉；

92、d.0.01％硫酸阿托品中浓度纳米基质滴眼液的制备：按照蛋白多糖冻干粉：硫酸阿托品的质量比50:1的比例，取步骤c制得的蛋白多糖冻干粉50g与硫酸阿托品药物1g，进行混合，加入纯净水至10000g，搅拌均匀使其溶解，形成混合溶液；使用高压均质机对混合溶液进行高压均质法纳米化处理，压力参数为800pa，进行3次循环处理，每次20分钟，制得硫酸阿托品浓度为0.01％、纳米基质浓度为0.5％的硫酸阿托品纳米基质滴眼液。

93、5号样品(次高浓度纳米基质)：0.01％硫酸阿托品次高浓度纳米基质滴眼液。制备方法如下：

94、a.1％的透明质酸水溶液的制备：按照透明质酸：纯净水的质量比1：100的比例，称取1g透明质酸，溶于100g纯净水中，待充分溶解后，制得1％的透明质酸水溶液，待用；

95、b.蛋白多糖溶液的制备：按照明胶：透明质酸的质量比12：1的比例，称取12g的明胶加入到步骤a制得的1％的透明质酸水溶液100g中，充分溶解，然后在5w/cm2紫外光线下，照射30分钟，进行交联化反应，制得蛋白多糖溶液；

96、c.蛋白多糖冻干粉的制备：将步骤b制得的蛋白多糖溶液放入冻存管中，放入冰箱中，在-20℃下预冻12h，然后再放入冷冻干燥机中，按照如下程序开机运行，程序：0℃下保持4h，然后-20℃下保持4h，然后-40℃下保持8h，然后-20℃下保持3h，然后-10℃下保持3h，然后0℃下保持3h，最后10℃下保持3h，制得蛋白多糖冻干粉；

97、d.0.01％硫酸阿托品次高浓度纳米基质滴眼液的制备：按照蛋白多糖冻干粉：硫酸阿托品的质量比100:1的比例，取步骤c制得的蛋白多糖冻干粉100g与硫酸阿托品药物1g，进行混合，加入纯净水至10000g，搅拌均匀使其溶解，形成混合溶液；使用高压均质机对混合溶液进行高压均质法纳米化处理，压力参数为800pa，进行3次循环处理，每次20分钟，制得硫酸阿托品浓度为0.01％、纳米基质浓度为1％的硫酸阿托品纳米基质滴眼液。

98、6号样品(高浓度纳米基质)：0.01％硫酸阿托品高浓度纳米基质滴眼液。

99、制备方法如下：

100、a.2％的透明质酸水溶液的制备：按照透明质酸：纯净水的质量比2：100的比例，称取2g透明质酸，溶于100g纯净水中，待充分溶解后，制得2％的透明质酸水溶液，待用；

101、b.蛋白多糖溶液的制备：按照明胶：透明质酸的质量比12：1的比例，称取24g的明胶加入到步骤a制得的2％的透明质酸水溶液100g中，充分溶解，然后在5w/cm2紫外光线下，照射30分钟，进行交联化反应，制得蛋白多糖溶液；

102、c.蛋白多糖冻干粉的制备：将步骤b制得的蛋白多糖溶液放入冻存管中，放入冰箱中，在-20℃下预冻12h，然后再放入冷冻干燥机中，按照如下程序开机运行，程序：0℃下保持4h，然后-20℃下保持4h，然后-40℃下保持8h，然后-20℃下保持3h，然后-10℃下保持3h，然后0℃下保持3h，最后10℃下保持3h，制得蛋白多糖冻干粉；

103、d.0.01％硫酸阿托品次高浓度纳米基质滴眼液的制备：按照蛋白多糖冻干粉：硫酸阿托品的质量比200:1的比例，取步骤c制得的蛋白多糖冻干粉200g与硫酸阿托品药物1g，进行混合，加入纯净水至10000g，搅拌均匀使其溶解，形成混合溶液；使用高压均质机对混合溶液进行高压均质法纳米化处理，压力参数为800pa，进行3次循环处理，每次20分钟，制得硫酸阿托品浓度为0.01％、纳米基质浓度为2％的硫酸阿托品纳米基质滴眼液。

104、1.3色谱条件

105、色谱柱：agilent eclipse plus c18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；

106、流动相：0.05mol/l磷酸二氢钾溶液(含0.0025mol/l庚烷磺酸钠)-乙腈(84∶16)；

107、检测波长：225nm；

108、柱温：30℃

109、进样体积20μl。

110、1.4对照品溶液的制备

111、硫酸阿托品储备液(0.18mg/ml)：取硫酸阿托品对照品9.3mg，精密称定，加水溶解并定量至50ml量瓶中，制成每1ml中含0.18mg的溶液，作为硫酸阿托品储备液。

112、硫酸阿托品使用液(9.11μg/ml)：精密量取硫酸阿托品储备液(0.18mg/ml)2.5ml，加水溶解并定量至50ml量瓶中，制成每1ml中含9.11μg的溶液，作为硫酸阿托品使用液。

113、1.5离体鼠皮的制备

114、取昆明种小鼠，脱颈处死后剥离腹部皮肤，剪净腹部的毛，小心剔除皮下脂肪组织，用生理盐水冲洗干净；切成小块(2.0cm×2.0cm)，浸于生理盐水中，于4℃冰箱保存备用，一周内用完。

115、1.6经皮渗透实验操作

116、实验采用改良franz扩散池，将制备好的离体皮肤用生理盐水冲洗干净，置于样品室与接受室之间，固定，角质层朝上，真皮一侧与接受液接触，排尽气泡，样品室与接受室直径均为2.2cm2，透皮面积为3.8cm2，接受池中加入20ml生理盐水，供给室中加入样品1ml，将安装好的franz扩散池置于(37±0.5)℃搅拌，采用循环水浴保温，磁力搅拌器的搅拌速度为350r·min-1，于0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h时间点，取接收液1ml，并补加等量的新鲜双蒸水，共取7个样，样品经空气泵吹干，加流动相0.2ml，涡旋振荡混匀使其充分溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，取20μl滤液注入hplc测定硫酸阿托品的含量，重复2次。

117、按下公式计算不同时间的硫酸阿托品累积释放百分率q＝pi/p0×100％，其中pi为不同时间测得的接受液中硫酸阿托品累积释放量，p0为释放池中加入样品的硫酸阿托品总量，q为不同时间的累积释放百分率。

118、1.7测定

119、精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，按本实验“1.3”中所述条件测定并记录色谱图。按外标法以峰面积计算。

120、2透皮吸收样品测定结果

121、透皮吸收样品测定结果见表6和附图6、附图7。结果显示：1号空白样品和6号高浓度样品在硫酸阿托品出峰位置未见相应色谱峰出现，因此未检出硫酸阿托品成分；2号、3号、4号、5号样品均随时间的延长硫酸阿托品含量逐渐增加，在16h时硫酸阿托品含量达到最高后趋于稳定，其中4号样品透皮吸收效果最好，透皮吸收16h测得2号样品、3号样品、4号样品、5号样品中硫酸阿托品累积释放百分率分别为80.51％、81.53％、85.71％和80.82％。

122、表6透皮吸收样品累积释放百分率(％)

123、

124、3讨论与结论

125、纳米基质，通过纳米技术，将明胶和透明质酸制备为纳米级，然后将明胶中的氨基酸的氨基与透明质酸的羧基进行反应，形成酰胺键，从而使也填水凝胶同时具备明胶和透明质酸的特性，并且产生新的理化特性。

126、明胶的氨基酸中含有氨基(-nh2)、亚氨基(-nh)、羧基(-cooh)、羟基(-oh)，透明质酸中含有羧基(-cooh)、羟基(-oh)和酰胺基(-conh-)，他们之间能够发生酸碱、酯化、美拉德(maillard reaction)等多种反应，能够产生酰胺基(-con-)、酯基(-coo-)、等新的官能团，可以将明胶与透明质酸有机结合在一起，形成新化合物。

127、纳米基质，有别于纳米级的明胶和纳米级透明质酸，他们在溶液中的状态应该是不一样的，因为纳米基质的流动性发生很大改变，相比于同等浓度的明胶和透明质酸，其粘度降低很多，其微观结构具体是已经发生根本性变化，通过场发射透射电镜检测平均直径：8～15nm，其表面积越大，所接触的水分子就越多，而纳米基质颗粒之间的相互作用力减弱，从而导致液态水凝胶的粘度系数显著降低，同时也使纳米基质有非常好的渗透性，能够更快浸润皮肤角质层，透过细胞间，甚至都已经达到穿越细胞膜的水平，因此液态水凝胶具有更强的透皮吸收作用。

128、纳米基质的透皮效果与其浓度不成线性关系，并不是随着浓度增加其透皮效果就增加，通过实验结构发现其浓度为0.5％时，其透皮效果最佳，主要也是由于纳米基质的蛋白多糖内部还存在大量氢键和离子键，导致纳米基质浓度大于0.5％时，其分子间碰撞机会增加，分子间相互作用力增强，使其透皮效果减弱。