一种治疗白内障的生物制剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种治疗白内障的生物制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、白内障是以晶状体浑浊、透明度降低为特征的常见致盲性眼部疾病。据统计，全球有9500万人患有白内障，数千万患者因白内障而致盲。衰老、遗传突变、创伤、辐射、药物、代谢异常和营养失调等因素均可影响晶状体，导致晶状体浑浊形成白内障。年龄是白内障的主要相关因素，50％以上的白内障患者为年龄相关性白内障。年龄相关性白内障常见于中老年人，随着年龄增加，发病的概率也随之升高，70岁以上人群中白内障的发病率超过80％。

2、迄今为止，临床上没有有效治疗白内障的药物。目前白内障治疗手段是通过手术方式将浑浊的晶状体取出，然后植入人工晶状体。然而，手术治疗存在治疗费用高，伴随严重并发症风险等缺点。此外，有些高龄白内障患者由于体质虚弱、合并多种疾病等原因，无法耐受外科手术而得不到有效治疗，因此迫切需要其它替代性治疗方案。

3、羊毛甾醇是存在于晶状体的一种两亲性分子，是胆固醇合成途径中的关键环合反应中间产物，由羊毛甾醇合酶(lanosterol synthase,lss)催化合成。有研究表明，羊毛甾醇可通过降低晶状体蛋白的异常聚集改善白内障症状，但羊毛甾醇溶解性低、临床常见眼部给药方式需克服眼部固有的角膜屏障和晶状体囊膜屏障等问题影响羊毛甾醇的治疗效果，限制了其进一步应用。

4、信使rna(messenger rna,mrna)是以dna为模板，通过转录得到的携带遗传信息的一类单链核糖核酸，能指导蛋白质的合成。mrna药物的优势在于：mrna理论上能表达任何蛋白；mrna无需进入细胞核即可在细胞质翻译成目的蛋白，无基因整合风险；mrna可通过体外转录大量合成，合成成本相对低廉、研发周期短，可快速应用于多种疗法。目前mrna广泛应用于疫苗研发、肿瘤免疫治疗、先天性遗传性疾病、基因编辑等领域的研究。

5、然而mrna不稳定，体内易于被核酸酶降解失活。另外，mrna本身缺乏器官靶向性，难以在特定器官表达有效治疗量的蛋白。脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,lnps)作为mrna的递送载体，目前已成功用于mrna疫苗的制备，但目前用于白内障治疗的研究未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种治疗白内障或晶状体浑浊导致相关疾病的生物制剂及其制备方法和应用。

2、第一方面，本发明提供了一种治疗白内障或晶状体浑浊导致相关疾病的生物制剂，其包括脂质纳米颗粒及其负载的羊毛甾醇合酶mrna；

3、所述羊毛甾醇合酶mrna为如下任一种：

4、a1)编码区序列为seq id no.1的核酸分子；

5、a2)与a1)中seq id no.1所限定的序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上、75％以上、70％以上、65％以上或60％以上同源性且具有相同功能的核酸分子；

6、a3)将a1)或a2所述核酸分子的序列中的核苷酸进行化学修饰，得到具有相同功能的核酸分子。

7、上文a3)中，将a1)或a2所述核酸分子的序列中的核苷酸进行化学修饰可以为将a1)或a2所述核酸分子的序列中的尿嘧啶进行化学修饰，在本发明的实施例中具体为尿嘧啶的5mou修饰。

8、上文所述的生物制剂中，所述a1)所示的mrna包括所述编码区序列及在其末端添加的帽子结构、非翻译区和多聚腺苷酸尾中的任意一种或至少两种的组合。本发明以从上海伟寰生物科技有限公司(apexbio)定制的羊毛甾醇合酶mrna为例。

9、上文所述生物制剂中，所述脂质纳米颗粒的原料包括可离子化脂质和辅助脂质；

10、或，所述脂质纳米颗粒的原料包括还包括可离子化脂质、辅助脂质和聚乙二醇脂质。

11、上文所述生物制剂中，所述可离子化脂质和所述辅助脂质的摩尔比为1:1；

12、或，所述可离子化脂质、所述辅助脂质和所述聚乙二醇脂质的摩尔比为20-60:20-60:1。

13、在本发明的实施例中，所述可离子化脂质、所述辅助脂质和所述聚乙二醇脂质的摩尔比以40:40:1为例。

14、上文所述生物制剂中，所述可离子化脂质如式i所示：

15、

16、或，所述辅助脂质选自如下至少一种：1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰基卵磷脂、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1,2-肉豆蔻-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、二油酰磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、鞘磷脂、神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂或二酰基甘油、胆固醇、3β-[n-(n',n'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、粪固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚；

17、或，所述聚乙二醇脂质选自peg改性的磷脂酸、peg改性的磷脂酰乙醇胺、peg改性的神经酰胺、peg改性的二烷基胺、peg改性的二烷基甘油、peg改性的二酰基甘油中的任意至少一种。进一步地，所述聚乙二醇脂质优选为1.2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000、二硬脂酰-rac-甘油-聚乙二醇2000、n-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、n-(羰基－甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、peg-二酰基甘油酰胺、peg-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺。

18、上文所述的生物制剂中，所述mrna在所述生物制剂中的浓度为1-1000ng/μl；在本发明的实施例中mrna在生物制剂中的浓度以0.02mg/ml或0.22mg/ml为例。

19、或，所述可离子化脂质中n原子与所述mrna中p原子的摩尔比为2:1。

20、上文所述生物制剂的水合粒径为150-300nm。

21、上文所述生物制剂为液体制剂或注射制剂。

22、上文所述生物制剂为羊毛甾醇合酶mrna在脂质的静电吸附作用下自组装为纳米粒的生物制剂，从而保护mrna不被降解，并促进mrna的跨膜转运。

23、第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述生物制剂的方法，包括如下步骤：

24、b1)制备mrna水相和有机相；

25、所述mrna水相是将羊毛甾醇合酶mrna溶解在溶剂中得到mrna水相；

26、其中，采用的溶剂为缓冲液或无酶水；在本发明的实施例中，所述缓冲液进一步具体为pbs缓冲液；

27、所述有机相为将可离子化脂质、辅助脂质、聚乙二醇脂质按摩尔比40:40:1溶解在有机溶剂中，得到有机相；

28、b2)将所述mrna水相和所述有机相按体积比1:9进行混合，静置，得到生物制剂；

29、所述有机相的可离子化脂质中n原子与所述水相中mrna的p原子的摩尔比2:1；

30、所述羊毛甾醇合酶mrna在所述生物制剂中的浓度为1-1000ng/μl。

31、上文中，所述有机溶剂为醇类溶剂；所述醇类溶剂进一步具体为甲醇和/或乙醇。

32、第三方面，本发明提供了第一方面或第二方面所述方法制备的生物制剂在制备如下至少一种功能产品中的应用：

33、c1)治疗或预防白内障；

34、c2)治疗或预防晶状体浑浊导致相关疾病；

35、c3)延缓白内障发展进程；

36、c4)改善白内障；

37、c5)提高晶状体中羊毛甾醇含量。

38、第四方面，本发明提供了一种产品，其包括第一方面所述的生物制剂。

39、上文所述产品的给药方式为玻璃体给药、前房给药或结膜下给药；

40、或，所述产品具有如下至少一种功能：

41、c1)治疗或预防白内障；

42、c2)治疗或预防晶状体浑浊导致相关疾病；

43、c3)延缓白内障发展进程；

44、c4)改善白内障；

45、c5)提高晶状体中羊毛甾醇含量。

46、第五方面，本发明提供了第一方面中的所述羊毛甾醇合酶mrna；

47、或本发明提供了第一方面中的所述羊毛甾醇合酶mrna在制备如下至少一种功能产品中的应用：

48、c1)治疗或预防白内障；

49、c2)治疗或预防晶状体浑浊导致相关疾病；

50、c3)延缓白内障发展进程；

51、c4)改善白内障；

52、c5)提高晶状体中羊毛甾醇含量。上文所述产品为药物，所述产品进一步为液体制剂，更进一步具体为注射制剂。

53、在某些实施方式中，所述药物的给药方式为玻璃体给药、前房给药、结膜下给药或视网膜下给药，优选为玻璃体注射或前房注射。

54、在本发明中，所述药物制剂的使用剂量，每一眼球的单次mrna给药剂量范围为0.1-2000ng/g(mrna质量/动物重量)。

55、上文所述产品中，其活性成分为编码羊毛甾醇合酶mrna，其目的是治疗晶状体浑浊。

56、本发明对所述pbs缓冲液和乙醇的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的pbs缓冲液和乙醇即可。

57、本发明对所述玻璃体注射和前房注射的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规的玻璃体注射和前房注射操作即可。

58、本发明的脂质纳米颗粒具有良好的mrna递送效率，可跨越晶状体屏障将mrna递送至晶状体内并翻译成羊毛甾醇合酶，从而提高晶状体内羊毛甾醇浓度。研究一种能够有效预防、治疗白内障的mrna药物，将具有非常重要的临床价值和社会意义。

59、本发明提供一种治疗白内障的生物制剂及其在白内障领域的应用。所述生物制剂包括递送载体以及负载于所述递送载体的mrna。所述递送载体包括含有可离子化脂质的脂质纳米颗粒。所述可离子化脂质具有如图2所示结构。所述mrna为编码羊毛甾醇合酶的mrna。所述mrna的编码区包含如seq id no.1所示的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少60％同一性的序列。本发明将负载羊毛甾醇合酶mrna的脂质纳米制剂递送至白内障动物模型眼部玻璃体或前房中，所述纳米制剂可通过晶状体囊膜进入晶状体并翻译成相应的羊毛甾醇合酶，从而使晶状体中羊毛甾醇浓度上调，晶状体浑浊程度降低，最终达到延缓白内障发展进程、治疗白内障的目的。本发明提供的mrna制剂具有制备工艺简单，批次之间稳定性好，药物起效快，对白内障的发生发展具有良好的预防和治疗效果。

60、本发明的有益效果：本发明提供的mrna生物制剂，包括mrna脂质纳米载体和所负载的羊毛甾醇合酶mrna。将所述生物制剂注射到眼部玻璃体和前房后，可提高眼部晶状体中细胞羊毛甾醇合酶表达，从而提高晶状体中羊毛甾醇的含量，降低晶状体蛋白的聚集，预防和减轻白内障的发生和发展。本发明在通过皮下注射亚硒酸钠溶液造模的白内障大鼠模型中观察到，将生物制剂注射到大鼠一侧眼部玻璃体或前房，可预防和减轻晶状体白内障，其晶状体透明程度明显高于另外一侧。

61、根据本发明的上述内容，依照本领域的技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改和替换。

62、以下通过实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。