基于无级调节中继光路的多尺度光声显微镜及其成像方法

本发明涉及光学设计、自动控制以及成像，具体涉及一种基于无级调节中继光路的多尺度光声显微镜及其成像方法。

背景技术：

1、生物组织的单次大视场成像在快速寻找感兴趣区域、快速获取全器官信息以及同时成像跨区域的活体生物关联性生理信息等方面具有重要意义。与此同时，能够获取感兴趣区域的精细结构，可大大拓展光声成像系统可研究的生物学问题。

2、为获取大视场范围内的生物组织精细结构信息或生理信息，需要获得高分辨率和大视场的光声图像，但当前的光声显微系统往往受限于其所使用的扫描机制或光学激发系统固有的空间带宽积，无法满足大视场范围跨区域多尺度的高分辨率成像需要。其中，传统的光学分辨率光声显微通常采用高性能机械扫描装置来实现对成像端或样品的稳定精确扫描，但大的驱动力和所移动物品质量严重限制了成像速度。用光学扫描代替机械扫描可显著提升成像速度。当前光学扫描结构主要分为两种：透镜后扫描和透镜前扫描。透镜后扫描结构需要足够的工作距离以供放置扫描镜，因而限制了高数值孔径物镜的使用，难以进行高分辨率成像，其视场主要受限于平场扫描范围或扫描镜的最大扫描角度；相反，透镜前扫描结构对工作距离的要求更小，允许使用高数值孔径进行高分辨率成像，现有系统中，线聚焦超声换能器的使用已显著扩展了声学探测视场，使得透镜前扫描的光声成像系统视场仅受光学激发范围的限制，但现有的透镜前扫描系统直接在透镜入瞳前方一定距离处进行扫描，并没有充分利用透镜的视场。

3、针对以上问题，国内外小组已对各种扫描机制下大视场高分辨率成像做出了各种探索，一些通过机械移动多次扫描配合图像拼接的方法提升整个系统的大范围高分辨率成像能力的方法是有效的，但系统及后期处理的复杂度明显增加。且这些系统一经搭建完成，其分辨率和最大成像视场无法调整，难以适应对生物组织不同尺度信息成像的需求。光学分辨率与声学分辨率双模式光声显微系统仅在深度方向改变视场，且大深度视场下横向分辨率劣化严重。扫描透镜与显微物镜切换聚焦光声显微系统可为系统提供两种光学激发模式，但两种模式的显著工作距离差异使得切换过程中样品的重新定位较为困难。

技术实现思路

1、（一）要解决的技术问题

2、为提升单系统大视场高分辨率成像性能，实现多尺度成像，本发明提出了一种新型视场及分辨率无级调节成像方式，具体为一种基于无级调节中继光路的多尺度光声显微镜及其成像方法，它可以适应生物组织不同尺度的感兴趣区域成像及不同尺度的细节分辨要求，使得系统能够获得更多的样品信息，大大增加了系统的应用价值。

3、（二）技术方案

4、本发明为解决其技术问题，提供了一种基于无级调节中继光路的多尺度光声显微镜及其成像方法，具体技术方案如下。

5、基于无级调节中继光路的多尺度光声显微镜，其特征在于，包括：激光源组件、光斑优化组件、中继光路调制扫描组件、反射式成像端口组件、探测组件、信号处理组件及计算机；

6、所述激光源组件沿光轴出射至少两种不同波长的平行脉冲光束，光束依次经过所述光斑优化组件、中继光路调制扫描组件和反射式成像端口组件照射到成像目标，用于激发成像目标的光声信号并同步触发信号；

7、所述光斑优化组件用于光束的整形与扩束；

8、所述中继光路调制扫描组件包括二维扫描振镜、可调中继光路和显微物镜，所述二维扫描振镜用于光束的扫描；所述可调中继光路沿光轴从物方到像方依次包括会聚透镜和套筒透镜，用于调节系统的工作模式；所述显微物镜用于将光束聚焦在成像目标上；其中，在极限高分辨率模式到极限大视场模式的调节过程中，会聚透镜沿光轴从物方向像方进行轴向移动；

9、所述中继光路调制扫描组件结构，符合以下关系式：，其中dgt为所述二维扫描振镜的光学扫描中心与套筒透镜的主面中心之间的轴向间距，d0为所述二维扫描振镜的光学扫描中心处的光束直径，dobj为所述显微物镜的入瞳直径，ftl为所述套筒透镜的有效焦距；

10、所述中继光路调制扫描组件结构，符合以下关系式：，其中d0为所述二维扫描振镜的光学扫描中心处的光束直径，dobj为所述显微物镜的入瞳直径，fl为所述会聚透镜的有效焦距；

11、所述中继光路调制扫描组件结构，符合以下关系式：，其中fl为所述会聚透镜的有效焦距，dlt为所述会聚透镜的主面中心与所述套筒透镜的主面中心之间的轴向间距；

12、所述反射式成像端口组件包括光-声信号同轴耦合装置和二维位移组件；所述光-声信号同轴耦合装置具有光学透射与声学反射特性，用于实现激发光束与光声信号的同轴耦合，并将成像目标产生的光声信号传递给所述探测组件；所述二维位移组件用于移动待成像样品；

13、所述探测组件包括线聚焦超声换能器、旋转电机、传动齿轮组和电机控制器，所述旋转电机带动线聚焦超声换能器旋转，用于保持光焦点与声焦线在激发光束旋转扫描时始终重合，实现样品光声信号的三维探测；

14、所述信号处理组件用于对所述探测组件捕获的信号进行电学处理与数据采集，所采集的数据传递给所述计算机进行后续处理；

15、所述计算机用于实现中继光路调制扫描组件中振镜的扫描控制、会聚透镜的位移控制，实现探测器组件中旋转电机的同步控制，也用于光声信号重建及图像处理。

16、优选地，所述中继光路调制扫描组件的工作方式为，多波长平行光束由二维扫描振镜扫描，由可调中继光路调制，再由显微物镜聚焦照射样品；

17、所述可调中继光路包括会聚透镜和套筒透镜，用于将振镜光学扫描中心共轭至显微物镜前焦点之后的有限范围内，同时将振镜处准直的激光光束调节为显微物镜入瞳处发散的光束；

18、所述会聚透镜被固定在轴向位移台上，轴向位移台用于在套筒透镜前会聚透镜的一倍焦距外至二倍焦距内沿光轴轴向移动会聚透镜，用于调节显微物镜前光束的多种特性，包括光学扫描中心共轭点与显微物镜前焦点的相对位置、显微物镜入瞳处的光束发散角和半径，以此方式无级调节光学激发的视场角、有效数值孔径、实际工作距离，无级调节视场及横向分辨率，并在显著扩大视场的同时保持分辨率在相同水平，实现多尺度高分辨率成像。

19、优选地，所述中继光路调制扫描组件通过无级调节所述会聚透镜位置，从而在极限大视场模式、极限高分辨率模式及介于二者之间的任意模式内转换工作模式；

20、在极限大视场模式下，调节所述会聚透镜与所述套筒透镜间隔最小，光学扫描中心共轭点与显微物镜前焦点间隔最小但仍然位于前焦点之后，显微物镜入瞳处光束发散角最大、光束半径最小，从而导致光学激发的实际工作距离最大、视场角最大、有效数值孔径最小、光学焦点尺度最大，最终实现极限大视场成像；

21、在极限高分辨率模式下，调节所述会聚透镜与所述套筒透镜间隔最大，光学扫描中心共轭点与显微物镜前焦点间隔最大且位于显微物镜入瞳之后，显微物镜入瞳处光束发散角最小、光束半径最大、从而导致光学激发的实际工作距离最小、视场角最小、有效数值孔径最大、光学焦点尺度最小，最终实现极限高分辨率成像。

22、优选地，所述激光源组件包括函数发生器和多个波长的快速纳秒脉冲激光器，其间电气连接，函数发生器提供激光器脉冲的外触发时序并同步系统的采集时序；所述多个波长的快速纳秒脉冲激光器的出射光束沿光轴入射光斑优化组件，经中继光路调制扫描组件、反射式成像端口组件聚焦照射在成像目标处激发其光声信号；

23、所述光斑优化组件沿光轴从物方到像方依次包括光圈和空间光滤波器，用于脉冲激光束的整形与扩束，符合以下关系式：，其中d0为所述二维扫描振镜的光学扫描中心处的光束直径，m为所述空间光滤波器的光束半径放大倍率，diris为所述光圈出射的光束直径；

24、所述信号处理组件包括电学放大器、带通滤波器和数据采集卡，由所述探测组件输出的电信号经电学放大器放大、带通滤波器滤波、由数据采集卡进行模拟-数字信号转换传递给所述计算机进行后续处理。

25、优选地，所述激光源组件用于发出不同波长的脉冲激光光束；所述光斑优化组件对各波长光束分别处理，具体是所述光圈用于调节各波长光束的能量，所述空间光滤波器用于去除光源高频噪点并扩束，确保所述中继光路调制扫描组件在极限高分辨率模式下时，显微物镜入瞳的光束填充率接近1；所述光斑优化组件还包括二向色镜与反射镜，用于不同波长光束的合并。

26、优选地，所述中继光路调制扫描组件中，所述二维扫描振镜采用1片二维扫描振镜或2片一维扫描振镜；当采用1片二维扫描振镜时，光学扫描中心为振镜机械旋转中心；采用2片一维扫描振镜时，振镜正交组合，此时光学扫描中心为2片一维扫描振镜机械旋转中心连线的几何中心，若在2片一维扫描振镜之间进一步加入望远镜系统实现光瞳匹配时，光学扫描中心为第二片扫描振镜机械旋转中心。

27、优选地，所述反射式成像端口组件中，所述光-声信号同轴耦合装置用于激发光束的透射与光声信号的反射，其结构包括底部的石英玻璃密封片、内部的去离子水及倾斜嵌合的石英玻璃声学反射片、上部的聚乙烯密封膜以及表面涂敷的超声耦合凝胶；所述二维位移组件用于带动待成像样品移动，将感兴趣区域保持在成像视场中心。

28、优选地，所述探测组件中，所述线聚焦超声换能器的焦线中心点与光学激发聚焦扫描视场中心点重合；所述探测组件的工作方式为，光学焦点扫描线聚焦换能器的声焦线，超声换能器探测光学激发视场单直径的深度信号；完成单直径线探测后，光学焦点扫描线绕光学激发视场中心点旋转，声焦线与之同步，直至完成全视场直径线探测，此时线聚焦超声换能器绕中心轴旋转180°，获取光学激发全视场的深度信号，实现三维探测。

29、优选地，所述信号处理组件中，信号先由所述电学放大器、带通滤波器预处理以提升信噪比，再由所述信号采集卡同步采集；所述计算机与二维扫描振镜控制器、电机控制器、信号采集卡电气连接，用于全系统的同步控制。

30、本发明还公开了一种基于无级调节中继光路的多尺度光声显微镜成像方法，其采用前述的基于无级调节中继光路的多尺度光声显微镜进行成像，步骤如下：

31、步骤s1，对生物样品的成像区域预处理并涂敷超声耦合凝胶，将样品固定于二维位移组件样品架上，将成像区域紧贴于聚乙烯薄膜上；

32、步骤s2，在极限大视场模式下进行单次成像，具体是：可调中继光路被配置在极限大视场模式，即会聚透镜移动至极限大视场模式对应位置；对任意波长，激光器由函数发生器触发而发射脉冲激光，光束依次通过光圈、空间光滤波器，再经过二向色镜与其他波长激光合束，由二维扫描振镜扫描，再经中继光路中继，最后由显微物镜聚焦并激发样品光声信号，声信号经石英玻璃片反射，由线聚焦超声换能器转换为电信号，电信号经电学放大器、滤波器预处理，由信号采集卡采集，由计算机存储处理；当光焦点完成一层光学焦面的光声信号激发，声焦线同步旋转180°完成三维焦区内样品的三维信息获取；

33、步骤s3，用二维位移组件定量移动样品，重复步骤s2，直至完成大范围全部待成像区域的信号采集；用计算机重建并配准拼接，获取样品的大范围三维图像；

34、步骤s4，在图像中确定精细结构感兴趣区域中心及范围，结合采样间隔确定感兴趣区域成像所需视场，据此配置可调中继光路至极限高分辨率模式或介于两种极限模式之间的任意模式，进行精细结构感兴趣区域的单次成像，具体是：根据感兴趣区域对成像视场及分辨率的尺度要求，控制会聚透镜移动至对应位置；用二维位移组件定量移动样品，将感兴趣区域中心移动至当前模式成像视场中心；完成样品光声信号的激发、探测、处理和采集；

35、步骤s5，对于分散于大范围三维图像内的全部精细结构感兴趣区域，重复步骤s4，直至完成各区域的精细结构三维图像获取；

36、步骤s6，用计算机对样品的多尺度三维图像重建滤波，优化成像效果，用各区域的精细结构三维图像配准并替换大范围三维图像的对应区域，获取样品大范围且包含感兴趣区域精细结构的多尺度三维图像。

37、（三）有益效果

38、相对于现有技术而言，本发明具备显著积极的技术效果，其有益效果至少体现在以下几个方面。

39、（1）通过设计可调中继光路用于无级调节激发光的扫描视场尺度和焦点尺度，本发明提出的基于无级调节中继光路的多尺度光声显微成像装置能够对样品进行多尺度成像，且在显著扩增视场的同时保持分辨率在同一水平。相比于传统的光声显微成像，在保持高的光学分辨率的基础上，本发明提出的多尺度光声显微镜可以在不更改系统组件的情况下使用同一枚显微物镜，实现对分辨率和单次成像视场的无级调节。

40、（2）现有光学分辨率光声显微成像系统一经搭建，其横向分辨率无法进行无级调节，其光学激发视场也仅能基于机械扫描进一步扩大，为保证采样间隔与横向分辨率相匹配，大视场单次成像的扫描时间与视场面积成正比。通过本发明提出的基于无级调节中继光路的多尺度光声显微成像装置，在配置可调中继光路于极限大视场模式时，光焦点尺度也相应增加，进而可以减小空间采样频率以减少单次大视场成像扫描时间。

41、（3）现有光学分辨率光声显微成像系统以固定尺度的光焦点扫描，过小的光焦点会导致过高的光能量密度，引起组织热损伤的风险。利用本发明提出的基于无级调节中继光路的多尺度光声显微成像装置，在将会聚透镜向像方移动以靠近套筒透镜的过程中，光焦点尺度随光学扫描视场增加，能够在追求大的成像视野的应用场景下，增大光焦点尺度：一方面，在满足采样间隔与横向分辨率匹配的要求下，增大的光焦点尺度可以适配增大的采样间隔，减少了生物组织所在成像平面的光焦点数量；另一方面，单个光焦点所激发的生物样品体积更大，光能量密度更小。因此，本发明提出的多尺度光声显微成像装置能够在极限大视场模式下有效降低照射在生物组织中的激光能量密度，从而有效避免了组织的热损伤风险。

42、（4）将本发明提出的无级调节中继光路应用于光声显微成像，能够巧妙地基于单个会聚透镜的轴向移动将大视场与高分辨率这两大成像特征集成于同一系统之中，有效扩展了现有单个旋转式光声显微成像系统所能观测的生物学问题。以本系统所用4倍横向放大率、数值孔径为0.1的显微物镜为例，当可调中继光路被配置在极限高分辨率模式时，系统的横向分辨率可趋近于物镜的光学衍射极限达到5微米，满足毛细血管成像对分辨率的要求；当可调中继光路被配置在极限大视场模式时，系统的光学激发视场可超过物镜标称视场达到8.5毫米，满足小鼠全脑成像对视场的要求。此外，本系统仅通过单个会聚透镜的轴向移动即可实现在极限大视场模式、极限高分辨率模式以及介于二者之间的任意模式内转换工作模式，易于通过计算机进行自动控制，且具备小型化的应用潜力。

43、（5）本发明提出的无级调节中继光路的设计方案适用于不同放大倍率、不同数值孔径、不同尺寸的显微物镜，适用于不同尺度样品的多尺度成像需要。所述无级调节中继光路在应用于光声显微成像时适用于不同扫描方式及其对应的成像端口与探测组件，能够满足不同扫描及探测模式的多尺度成像要求。