基于STED三维结构照明显微镜去离焦噪声方法及系统

本申请涉及三维结构照明显微镜领域，特别是涉及基于sted三维结构照明显微镜去离焦噪声方法、系统。

背景技术：

1、三维结构照明显微镜(3d-sim)是荧光成像中的一种宽场成像超分辨率技术，可以将分辨率提高一倍，超过其经典极限。受激发射损耗(sted)荧光显微镜是通过激发光源将分子基态跃迁至激发态，再经sted光照，产生受激发辐射，消耗其发光能级(荧光态)上的颗粒数量，迫使颗粒在受到激发后立即返回基态。在此基础上，利用sted技术制备出具有较高发光效率的焦斑，使其发光范围小于衍射极限。

2、现有的三维结构照明显微镜成像技术轴向的分辨率一般在200～300nm之间，相较于水平方向分辨率相差较大。以往的研究人员通常采用3d结构光技术，在轴向方向上引入频率偏移，以提高图像的纵向分辨率。然而，目前基于3d结构光的超分辨技术仅能满足目前最大分辨能力的2倍，并且会降低获得图片的信噪比而导致超分辨率重构十分困难。

技术实现思路

1、基于上述问题，本申请提供了基于sted三维结构照明显微镜去离焦噪声方法及系统，用以提高轴向分辨率。

2、为解决上述问题，本申请实施例提供的技术方案如下：

3、本申请第一方面提供了一种基于sted三维结构照明显微镜去离焦噪声方法，包括：

4、利用荧光蛋白对样本进行标记；

5、搭建三维结构光光路和sted光光路；

6、设置三维结构光光路与sted光光路的slm图案，所述slm图案用于控制照射到样本上的sted光图案，以抑制离焦平面的荧光蛋白发光。

7、在一种可能的实现方式中，所述三维结构光光路包括：第一激光器、半波片、lcvr、四分之一波片、第一空间滤波器、第一透镜、第二透镜、物镜和scoms传感器，所述半波片用于将所述激光器的偏振激光束校准为偏振光；

8、所述三维结构光光路用于将来自slm的衍射图案由透镜聚焦经过lcvr与四分之一波片进而照射至空间滤波器。lcvr和四分之一波片用以确保光线始终与照明光偏振方向相同从而使干涉条纹的对比度最大，空间滤波器用于使0级和±1级光束通过，基于第一透镜和第二透镜将光束中继到聚焦在物镜的后焦平面上，将照明图案和样本的图像投影到scoms传感器上。

9、在一种可能的实现方式中，所述物镜为60×/1.49na油浸物镜。

10、在一种可能的实现方式中，所述sted光光路包括：第二激光器、半波片、二极管放大器、第二空间滤波器、第三透镜和第四透镜；

11、所述sted光光路用于将第二激光器发出的sted光通过二极管放大和单模光纤的第二空间滤波器后入射到slm上，形成横向上中心有狭缝的sted光图案，在经过第三透镜和第四透镜缩小获得sted光图案水平照射到样本上。

12、在一种可能的实现方式中，所述三维结构光光路的结构光采用占空比为30％的周期性slm像素模式。

13、在一种可能的实现方式中，所述slm的像素图案的水平或垂直像素周期为5。

14、在一种可能的实现方式中，所述slm在0°和60°方向的预设图案，分别用第一颜色和第二颜色的开和关像素显示。

15、在一种可能的实现方式中，所述sted光图案呈狭缝形状。

16、本申请第二方面提供了一种基于sted三维结构照明显微镜去离焦噪声系统，包括：

17、标记单元，用于利用荧光蛋白对样本进行标记；

18、搭建单元，用于搭建三维结构光光路和sted光光路；

19、设置单元，用于设置三维结构光光路与sted光光路的slm图案，所述slm图案用于控制照射到样本上的sted光图案，以抑制离焦平面的荧光蛋白发光。

20、在一种可能的实现方式中，所述三维结构光光路包括：第一激光器、半波片、lcvr、四分之一波片、第一空间滤波器、第一透镜、第二透镜、物镜和scoms传感器，所述半波片用于将所述激光器的偏振激光束校准为偏振光；

21、所述三维结构光光路用于将来自slm的衍射图案由透镜聚焦经过lcvr与四分之一波片进而照射至空间滤波器。lcvr和四分之一波片用以确保光线始终与照明光偏振方向相同从而使干涉条纹的对比度最大，空间滤波器用于使0级和±1级光束通过，基于第一透镜和第二透镜将光束中继到聚焦在物镜的后焦平面上，将照明图案和样本的图像投影到scoms传感器上。

22、相较于现有技术，本申请具有以下有益效果：

23、本申请通过利用荧光蛋白对样本进行标记；搭建三维结构光光路和sted光光路；设置三维结构光光路与sted光光路的slm图案，所述slm图案用于控制照射到样本上的sted光图案，以抑制离焦平面的荧光蛋白发光。即通过抑制离焦部分荧光粒子发光从而大大提高轴向上的分辨率并且提高获得图片的信噪比。利用sted光照技术，将sted光源引入到样品中，实现对样品的横向光照，有效的规避了三维结构光使用过程中存在的超分辨率的理论极限为现可达到最高分辨率的两倍，且会降低获得图片的信噪比而导致超分辨率重构十分困难的问题。由此，有效地抑制离焦面上的荧光分子的荧光，进而提高图像的纵向分辨率和图像的信噪比。

技术特征：

1.一种基于sted三维结构照明显微镜去离焦噪声方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三维结构光光路包括：第一激光器、半波片、lcvr、四分之一波片、第一空间滤波器、第一透镜、第二透镜、物镜和scoms传感器，所述半波片用于将所述激光器的偏振激光束校准为偏振光；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述物镜为60×/1.49na油浸物镜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sted光光路包括：第二激光器、半波片、二极管放大器、第二空间滤波器、第三透镜和第四透镜；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述三维结构光光路的结构光采用占空比为30％的周期性slm像素模式。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述slm的像素图案的水平或垂直像素周期为5。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述slm在0°和60°方向的预设图案，分别用第一颜色和第二颜色的开和关像素显示。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述sted光图案呈狭缝形状。

9.一种基于sted三维结构照明显微镜去离焦噪声系统，其特征在于，所述系统包括：

10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述三维结构光光路包括：第一激光器、半波片、lcvr、四分之一波片、第一空间滤波器、第一透镜、第二透镜、物镜和scoms传感器，所述半波片用于将所述激光器的偏振激光束校准为偏振光；

技术总结本申请公开了基于STED三维结构照明显微镜去离焦噪声方法及系统，通过利用荧光蛋白对样本进行标记；搭建三维结构光光路和STED光光路；设置三维结构光光路与STED光光路的SLM图案，所述SLM图案用于控制照射到样本上的STED光图案，以抑制离焦平面的荧光蛋白发光。即通过抑制离焦部分荧光粒子发光从而大大提高轴向上的分辨率并且提高获得图片的信噪比。利用STED光照技术，将STED光源引入到样品中，实现对样品的横向光照，由此，有效地抑制离焦面上的荧光分子的荧光，进而提高图像的纵向分辨率和图像的信噪比。技术研发人员：金一,付朕安,陈怀安,戴俊康,竺长安受保护的技术使用者：中国科学技术大学技术研发日：技术公布日：2024/5/29