一种抗菌化合物及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：一种抗菌化合物及其制备方法和用途的制作方法一种抗菌化合物及其制备方法和用途所属领域本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种新结构的抗菌化合物及其发酵制备方 法和用途。背景技术：微生物的代谢产物是抗生素的主要来源，而放线菌是产生抗生素最主要的微生物 种类之一。自链霉素发现以来，已从放线菌中发现了大量的抗生素。近年来，人们从普通链 霉菌、极端环境放线菌、海洋放线菌和稀有放线菌中寻找新抗生素。如，庆大霉素、红霉素、 万古霉素、利福平等已成功应用于临床；应用于农作物病虫害防治的抗生素有谷氏菌素、灭 瘟素、抗霉菌素120、武夷菌素等。灭瘟素是土壤放线菌产生的一种抗菌素，其分子结构由一个胞啶咛(cytosinine) 核苷和一个β-氨基酸稻瘟菌酸(blastidic acid)组成。日本人Takeuchi等首先于1955 年从一株链霉菌Sti^ptomyces griseochromogenes2A-327的发酵液中发现灭瘟素A、B、C， 1968年最终确定其结构，1958年从同一菌株发酵液中分离得到了灭瘟素S的纯品，并很快 实现了产业化。我国于1959年由中国科学院微生物研究所从广东花县土壤中分离到其产 生菌-有色产色链霉菌(Str印tomyces griseochromogenes)。灭瘟素作为一种治疗性杀菌 剂，对病源细菌和真菌的细胞生长呈现了广泛的抑制效果。武夷霉素(miyiensis)是一种广谱、高效、低毒的核苷类农用抗生素，其产生菌 为1979年采自福建武夷山区的一株链霉菌——不吸水链霉菌武夷变种(Str印tomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)。武夷霉素为水溶性两性物质，目前已分离出组分A、B， 其中经鉴定确认组分A为具有胞苷骨架的核苷类抗生素。是国内尚未发现的新型核苷类抗生素。多抗菌素(polyoxin)又称多氧霉素、多效霉素、保利霉素，是一种多组分水溶性 广谱抗菌素，属内吸性肽嘧啶核苷酸抗性素类杀菌剂。1965年由日本最早发现，我国于 1967年由中国科学院微生物研究所发现，其产生菌为可可链霉菌阿索变种(Str印tomyces cacaoi var. asoensis)。中国的多抗霉素主要成分是多抗霉素A (polyoxin Α)和 B (polyoxin B)，由A至N共14种不同的同系物组成的混合物，商品中多抗霉素A和B的混 合物含量为84%。宁南霉素(ningnanmycin)是一种具有胞嘧啶核苷肽结构的广谱杀菌核苷类抗生 素，由诺尔其j 链霉菌西昌变禾中(Streptomyces noursei var. xichangensis)产生。其氨基 酸组分仅L型丝氨酸区别于谷氏菌素的D型丝氨酸。可用于防治多种作物细菌病害及病毒病害。抗霉菌素120(TF-120)是由刺孢吸水链霉菌北京变种产生的另一种嘧啶核苷类 抗生素，广谱抗真菌。其主要组分120-B经提纯鉴定是下里霉素(harimycin)，次要组分为 120-A 和 120-C 类似潮霉素 B(hygromycin B)和星霉素(asteromycin)。抑霉菌素(yimeimycin)为刺孢吸水链霉菌天目山亚种(Streptomyceshygrospinosis var. tianmushanensis η. var. Sang et al)产生白勺一禾中核^f 类抗生素，产生菌对白色假丝酵母、白粉病菌、纹枯病菌等真菌有抑制活性，对灰霉病菌、枯 萎病菌、稻瘟病菌的生长有较强的抑制活性。庆丰霉素(qingfengmeisu)是一种碱性水溶性胞嘧啶核苷类抗生素，由庆丰链霉 菌(Sti^ptomyces qingfengmyceticus)产生，其分子结构中含有与灭瘟素相似的胞嘧啶组 分-胞啶咛，是一种高效、无残留、对人畜安全、用途广泛的核苷类抗生素。灭粉霉素(mildiomycin)是1971年从新几内亚土壤中的 Streptomycesrimofaciens B-98891培养液中提取的一类碱性核苷类抗生素。其结构中还 有5-羟甲基胞嘧啶。M9M (ezomycin)是北泽链霄菌(Streptomyces kitazawaensis)产生的一种啼 啶核苷类抗生素，由Al、A2、Bi、B2、Cl、C2、Dl、D2等8种组分组成，其主要成分为Al，是一 种具嘧啶苷结构的抗生素。由放线菌Sti^ptomycesnitrazawaensis的近缘种产生，对灰霉 病有较好的防治作用。它的杀菌谱较窄，对人畜十分安全，对鱼类毒性也很低。N9705是云南省工业微生物发酵工程重点实验室从成都市郊区土壤中分离到一 株链霉菌，它能够代谢产生一种胞嘧啶核苷衍生物-N物质(命名为N9705)。谱图分析显 N9705是肽酰胞嘧啶核苷，而且活性试验表明此核苷具有广谱抗植物病原真菌、杀线虫作用 及抗肿瘤、抗病毒活性。本实验室在进行微生物代谢产物的研究过程中，发现一株放线菌经发酵产生一种 新的化合物，该化合物有很好的广谱抗菌生物活性，尤其对革兰氏阳性菌、植物病毒的抑制 活性很强，是一种新的抗生素，我们将其命名为新奥霉素。研究人员经过长期大量的研究工 作，完成了该化合物的分离纯化、理化性质研究、结构鉴定；对该放线菌进行了菌种遗传改 良，获得了高产菌株，并研究获得了高产菌株发酵生产该新抗生素的优化发酵工艺条件，从 而完成了本发明。发明内容本发明的目的本发明的目的之一，是提供一种新结构的抗菌化合物，命名为新奥霉素；本发明的目的之二，是提供一种用于生产新奥霉素的新菌株；本发明的目的之三，是提供一种“批次液体培养基流加补料发酵工艺”，发酵生产新奥霉素；本发明的目的之四，是提供用于生产新奥霉素的培养基。更具体地说，本发明提供一种新结构的抗菌化合物(新奥霉素)及其发酵制备方 法，包含以下步骤从一株采自贡嘎山土壤的放线菌“诺尔斯链霉菌”(Sti^ptomyces noursei)的发 酵液中，经分离、鉴定获得一种新结构的抗菌化合物(新奥霉素)。将能够产生新奥霉素的放线菌“诺尔斯链霉菌”(Sti^ptomyces noursei)及其遗 传改良菌株，在一级液体培养基(例如，下文所述的培养基A)中培养，作为种子液；将培养 好的种子液接种到第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基B)中培养；第二级液体培 养基接种第一级种子液后培养一段合适的时间，开始进行流加补料液(例如，下文所述的补料液C)的补料发酵培养。发酵结束后，从上述发酵培养液中收集新奥霉素，并进行分离纯化、结构鉴定。本发明的具体实施方案是，采用“诺尔斯链霉菌”(Str印tomyces noursei)及其遗 传改良菌株“诺尔斯链霉菌XiAo-3” (Streptomyces noursei XiAo-3)，在液体培养基中进 行二级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基，例如下文所述的培养基A、B。在第二 级发酵中，接种第一级种子液后，在适合的温度下培养一段时间，例如，在26°C _32°C发酵 培养4-30小时后，选用合适的补料液，例如下文所述的补料液C，进行流加补料发酵培养。第二级液体培养流加补料(例如补料液C)的方式可以采用连续(勻速或非勻速) 流加和/或间歇式流加方式，连续流加方式是优选的。所述的连续(勻速或非勻速)流加方式，是以一定的流加速率，如0.01-4. OL/h， (勻速或非勻速)将适合的补料液(例如补料液C)连续流加入第二级发酵罐中，直至停止 发酵(下罐)前大约6-12小时。所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将适合的补 料液(例如补料液C)流加入第二级发酵罐中。间歇时间优选为每隔1-24小时补料2-10 次，优选为间隔2-5小时补料1次。本领域技术人员也可以根据需要，采用其他的适合时间 间隔补料。发酵条件温度26°C -32°C，PH :6_8发酵时间2-4天发酵结束后，采用薄膜浓缩技术方法浓缩发酵液。具体为，将发酵液经微滤去除 菌体、不溶性蛋白、胶体及其它大分子物质，微滤的操作压力为0. 1-0. 8Mpa，操作温度为 1-50°C，滤出液占进料液体积20% -90%，透析水量占进料液体积的30% -90%°C，合并滤 出液，备用。将微滤滤出液再经纳滤浓缩，所得浓缩液，减压蒸干，获得褐色膏状粗提取物。粗提取物再经正相硅胶层析，洗脱剂采用氯仿甲醇水=5 5 0.7，洗脱液 用管碟法进行活性跟踪检测，收集活性部分；正相硅胶层析的活性部分再用反相硅胶层析 分离，洗脱剂用甲醇水=2 8，得到的活性样品进行高效液相色谱纯化制备(制备条件 色谱柱为 SP-120-5-0DS-BI0 4. 6mIDmX150mm，流动相甲醇水=2 8，流速0. 8ml/min, 进样量10ul，检测器SPD-10A)，获得一种具有抑菌作用的白色粉末状单一化合物(新奥霉 素)。通过对该单一化合物的紫外_可见光波段扫描分析、质谱分析、分子量测定、一 维和二维核磁共振分析等，获得该单一化合物的化学结构为1-尿嘧啶-4-肌氨酰-丝氨 酰氨基-1，4- 二脱氧-β -D-吡喃葡萄糖醛酸，其结构有三大构件尿嘧啶、氨基己糖和二 肽，具有典型的核苷肽类化合物的特性，属于尿嘧啶己糖二肽，其分子量为445，分子式为 C16H23N5Oltl，其特征在于紫外光下显黄绿色荧光、茚三酮反应阳性、双缩脲反应阳性；其化学 结构为权利要求一种抗菌化合物，命名为新奥霉素，其化学结构式如下F2009100601214C0000011.tif2.权利要求1所述的化合物，其特征在于该化合物的分子量为445，分子式为 C16H23N5Oltl，化学名称为1-尿嘧啶-4-肌氨酰-丝氨酰氨基-1，4- 二脱氧-β -D-吡喃葡萄 糖醛酸，属于尿嘧啶己糖二肽，紫外光下显黄绿色荧光、茚三酮反应阳性、双缩脲反应阳性。3.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征是采用放线菌诺尔斯链霉菌 Streptomyces noursei及其遗传改良菌株，在一级液体培养基A中培养，作为种子液；将培 养好的种子液接种到第二级液体培养基B中培养，并进行流加补料液C的补料发酵培养；发 酵结束后，从发酵培养液中分离纯化出该结构化合物。4.根据权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征是诺尔斯链霉菌Streptomyces noursei的遗传改良菌株为诺尔斯链霉菌XiAo-3，Streptomyces noursei XiAo-3，已于 2009年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2898。5.根据权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征是所述培养基A的组成质量 百分比为葡萄糖0.5% -5.0%，蛋白胨0.3% -5.0%，玉米粉0.5% -5. O %，大豆饼粉 0. 5% -5. 0%，酵母粉 0. 1% -2. 0%，硫酸镁 0. 05% _1.0%，磷酸二氢钾 0. 1% -1.0%。6.根据权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征是所述的培养基B的组成质量百分比为成分—-般范围优选范围淀粉0.1% -5.(3%0.3% -3 0%甘油0.1% -3.(3%0.3% -3 0%蔗糖/糖蜜0. 1% -4.0%0. 3% -3. 0%硫酸铵0.01% -2.0%0.1% -2, 0%葡萄糖0.1% -10.0%0.5% -6, 0%蛋白胨0.3% -10.0%0.5% -8, 0%黄豆粉或黄豆粉水解液0.1% -10.0%0.5% -5 0%花生粉或花生粉水解液0.1% -10.0%0.5% -5 0%生物氮素0.1% -10.0%0.5% -5 0%玉米粉0.1% -10.0%0.5% -5 0%酵母粉0.01% -4.0%0.1% -2. 0%磷酸氢二钾0.01% -5.0%0.05% -1. 0%硫酸镁0.01% -5.0%0.05% -1. 0%氯化钠0.01% -5.0%0.05% -1. 0%氯化钙0.01%-5.0%0.05% -1.0%7.根据权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征是所述的补料液C的的组成质 量百分比为成分一般范围优选范围蔗糖/糖蜜0. 1%-4. 0%0. 3%-3. 0%葡萄糖0. 1% --10. 0%0. 5% --6. 0%淀粉0. 1% --5. 0%0. 3% --3. 0%黄豆粉或黄豆粉水解液0. 1% --10. 0%0. 5% --5. 0%花生粉或花生粉水解液0. 1% --10. 0%0. 5% --5. 0%过氧化氢0. 01%-5. 0%0. 05%-2. 0%酵母粉0. 01%-4. 0%0. 1% --2. 0%8.根据权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征是所述的流加补料的方式为连 续流加或/和间歇流加方式，连续流加方式是优选的。9.根据权利要求8所述的化合物的制备方法，其特征是采用连续流加方式是以 0.01-4. OL/h的速度连续流加补料液C，直至停止发酵前6-12小时；采用间歇式流加补料液 方式是每隔1-24小时补料2-10次，优选为每隔2-5小时补料1次，每次补料量为发酵液总 体积^O. 01% -1.5%,优选为 0. 05% -0. 3%010.权利要求1所述的抗菌化合物在农药或医药产品制造中的用途。全文摘要本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种抗菌化合物及其发酵制备方法和用途。本发明抗菌化合物，分子量为445，分子式为C16H23N5O10，化学名称为1-尿嘧啶-4-肌氨酰-丝氨酰氨基-1，4-二脱氧-β-D-吡喃葡萄糖醛酸，属于尿嘧啶己糖二肽，命名为新奥霉素。采用放线菌诺尔斯链霉菌Streptomyces noursei及其遗传改良菌株，在一级液体培养基A中培养，作为种子液；将培养好的种子液接种到第二级液体培养基B中培养，并进行流加补料液C的补料发酵培养；发酵结束后，从发酵培养液中分离纯化出该结构化合物。该抗菌化合物用于农药或医药产品的制造。本发明具有产率高、工艺简单、易于工业化的特点。文档编号C07K5/062GK101967182SQ20091006012公开日2011年2月9日 申请日期2009年7月27日 优先权日2009年7月27日发明者刘 东, 周金燕, 李志东, 杨杰, 肖亮, 谭红, 钟娟 申请人:中国科学院成都生物研究所