一种快速诱导提取猪肝金属硫蛋白的方法

专利名称：一种快速诱导提取猪肝金属硫蛋白的方法技术领域：本发明涉及金属硫蛋白的制取方法，更具体涉及一种快速诱导猪肝金属硫 蛋白的方法。背景技术：金属硫蛋白(MT)具有强烈的消除自由基的作用，可作为营养添加剂单独 使用或与谷胱甘肽(GSH)、维生素C (VC)、维生素E (VE)等配合使用，能 够有效地抑制脂质过氧化损伤、保护细胞、降低血液粘度、改善血液循环和提 髙机体免疫等多种生物学功能。金属硫蛋白还可以作为一种抗氧化剂使用，防 止食品或词料氧化变质。另外，金属硫蛋白能与许多金属离子结合，参与机体 金属代谢调节，平衡机体金属离子稳态，参与金属离子运转与排泄，对矿物质 营养起着重要作用。金属硫蛋白作为保健、防护以及美容化妆品的添加剂和某 些疾病的治疗药物在医学、食品加工、营养学等各个领域业己广泛应用。含有锌的金属硫蛋白(Zn-MT)是一种正四面体金属巯基螯合族，结晶构 相相当稳定，但它仍可通过提供Zn而激活许多以Zn为辅基的酶。因此开展锌 诱导金属硫蛋白合成的研究有着重要的理论价值和广阔的应用前景。本发明较已有的猪肝金属硫蛋白提取方法诱导时间短，采用先口腹再注射 的诱导方法，猪只应激小，提取工程较己有的猪肝金属硫蛋白提取方法减少了 离心的次数，而诱导提取的金属硫蛋白含量与己有的方法提取的金属硫蛋白含 量相当。发明内容本发明的目的就在于克服原有技术存在的问题和不足，在于提供了一种快 速诱导提取猪肝金属硫蛋白的方法。采用先口腹再注射的诱导方法，变3次离 心为2次离心，每克猪肝可含金属硫蛋白8mg左右，与原有技术诱导提取金属硫蛋白量相当。本发明的目的是这样实现的用哺乳猪作为供体，经口腹4-6天含有自配 微量元素锌添加剂的仔猪饲料，然后腹腔注射诱导，2-4次诱导后宰杀，从猪 的肝脏中分离提取一种具有稳定性好，纯度高的金属硫蛋白，诱导时间较"一种猪肝金属硫蛋白提取方法"縮短三分之一，并且口腹诱导4-6天可以大大缓解猪的应激及其副作用，减少注射诱导的次数和时间，提取过程简化，而得率与"一种猪肝金属硫蛋白提取方法"相当(专利号为200410013212. X)。更具 成本低，效果好，产量高，诱导剂来源广，无副作用等特点。且猪是一种饲养 非常普遍的动物，来源广，金属硫蛋白可用于人类保健、防辐射、美容、伤口 修复和畜禽饲料抗氧化与抗应激效应中。经诱导提取金属硫蛋白后，猪肉可照 常供食用。一种快速诱导提取猪肝金属硫蛋白的方法，其步骤如下① 猪肝金属硫蛋白的诱导选用健康的小猪关在笼内，用自配的含1500-2500ppm硫酸锌添加剂的仔 猪饲料饲喂小猪4-6天，再用硫酸锌(ZnS04)溶液腹腔注射，进行2-4次的剂 量递增的诱导，每次剂量为50-150mg/kg体重。采用先口腹锌，再锌剂量逐渐递增的溶液进行腹腔注射诱导，先口腹 1500卯m-2500ppm的锌，当体内鋅浓度大幅度增加时，再注射锌，可以增强猪 对锌的耐受性和适应性，小猪不会发生瘁死现象，从而开发了小猪对MT诱导 合成的潜能，又保证了有充足的时间诱导MT的大量合成。② 金属硫蛋白的检测诱导完1-3天后屠宰，并将所取新鲜肝脏样品直接按巯基显色法对金属硫 蛋白的含量进行检测；同时将各样品冷冻温度控制在-18°C—一22°C， 10-15 天后取出对金属硫蛋白含量进行再检测。要求每lg猪肝中可提取的金属硫蛋 白》5mg。③ 粗提将检测合格的新鲜猪肝脏捣碎，用Tris-HCl搅拌匀浆，倒入烧杯，再加入 500mLTris-HCl和250mL乙醇-氯仿混合溶液，搅拌8-12分钟，低温离心 (10000rZmin， 4°C， 20min)。取上清液于另一离心管，放入78-82。C的水浴锅内水浴4-6min，取出后迅速冷却至室温(20°C-25t)，低温离心(10000r/min， 4°C, 20min)，离心后的上清液即为金属硫蛋白粗提液，放置于4。C备用。 ④纯化将粗提液经超滤浓縮，得浓缩液，在浓縮液中按体积比为l: 3于金属硫蛋白粗提液中加入乙醇放置过夜，取沉淀离心(10000r/min， 4'C， 20min)，离 心后的沉淀用O. lmol/L的NH4HC03溶液溶解至3倍体积，滤纸过滤。对滤液进行 S印hedex G-100柱层析，在柱面加入MT显色试剂(巯基试剂)对MT组分着色； 用O. lmol/LNH4HC03进行洗脱，流速控制20mL/min，每5分钟收集1管。将收集的 着色部分进行S印harose Fast Flow柱(30咖X300咖)层析，用O. OIM—O. 30 朋03进行梯度洗脱，自动收集器分管收集，每管5ml，紫外254nm监控，收集 两个峰尖部分洗脱液；在冷冻干燥箱中按程序升温冷冻干燥25小时，所得冻干 粉，即为MT自制纯品，含量为95X以上。分装将冻干粉分装待用。本发明具有以下优点和积极效果1、 现有技术从猪肝中提取金属硫蛋白是经过5次诱导，而本发明縮短了 诱导时间，由原来的5次縮短成3次，提取合成也优化了，由原来的3次低温 离心优化成2次低温离心。2、 一般诱导为单一的皮下注射或腹腔注射，因为注射次数多，不仅操作 繁杂、劳动强度大和成本高，而且猪只的应激强度大，易出现诱导液扩散不畅、 堆滞的现象。采用先饲喂再腹腔注射，增强猪只对锌的耐受性和适应性，当锌 浓度大幅度增加时猪也不会发生瘁死现象，从而开发了猪对MT诱导合成的潜 能，又保证了有充足的时间诱导MT的大量合成。3、 得率高，每克猪肝可含金属硫蛋白8mg左右；4、 稳定性好，在低温条件下储藏时间较长。5、 本发明所提取的产品适用于人类保健、防辐射、美容、伤口修复和畜 禽词料抗氧化与抗应激效应中。具体实施例方式实施例1:一种猪肝金属硫蛋白的提取方法，其步骤如下① 猪肝金属硫蛋白的诱导选用健康5-10kg左右的商品猪，关在笼内。用含1500-2500ppm锌添加剂 的自配仔猪饲料饲喂小猪4天或5天或6天，再用ZnS04溶液采用腹腔注射法， 进行2次或3次或4次的剂量递增的诱导，每次剂量为50-150mg/kg体重。用配制好的ZnSO,. 7H20溶液采用腹腔注射法进行诱导，每隔一天诱导一次， 共诱导2次或3次或4次，每次剂量分别为50mg/kg、 100mg/kg、 150mg/kg， 累计300mg/kg。用猪为供体，通过3次诱导后使猪肝内所产生的MT的量为7.5mg/g，与5 次诱导的相当，却减少了猪只的应激和因应激和溶液扩散慢导致的死亡。② 检测诱导完后第二天屠宰取肝脏，并将所取新鲜肝脏样品直接按巯基显色法进行金属硫蛋白含量的检测，同时将各样品放置-18t:或-19"C或-2(TC或-2rC或 -22"C下冷冻，10天或11天或12天或13天或14天或15天后取出再检测金属硫蛋白含量。-18"或-19"或-20°(:或-2rC或-22"C下冷冻，10天或11天或12天或13 天或14天或15天后，各处理猪肝中MT的量均有所降低，但各处理下降幅度 不大(P〉0.05)。因此，本发明认为诱导猪肝MT合成的累计最佳锌诱导剂量为 330mg/kg，并且低温条件下金属硫蛋白较稳定，降解较缓慢，适合-4'C以下低温保存。③ 粗提将检测合格的新鲜肝脏捣碎，按新鲜猪肝25g用0. 02M Tris-HCl(pH8. 6)50ml搅拌匀浆，低温离心(10000r/min， 4。C， 20min)，取上 清液于另一离心管；取上清液于另一离心管；放入78。C或79。C或8(TC或8rC 或82"C的锅内水浴4或5或6rain，取出后迅速冷却至室温(20_25°C)，再冷冻 离心(10000r/min， 4°C， 20min)，取上清液并将上清液置于半透膜中，用PBS (pH7.4) IO倍体积，透析24小时。半透膜中剩余的溶液即为金属硫蛋白的粗6提液，放置于4匸备用。 ④纯化金属硫蛋白粗提液经3倍体积的无水乙醇沉淀，4-C放置过夜，取沉淀离 心(10000r/min， 4°C， 20min)，离心后的沉淀用0. lmol/L的朋4110)3溶液溶 解至3倍体积，滤纸过滤。对滤液进行S印hedex G-100柱层析，在柱面加入 MT显色试剂(巯基试剂)对MT组分着色；用0. lmol/U^HC03进行洗脱，流速 控制20mL/min，每5分钟收集l管。将收集的着色部分进行S印harose Fast Flow 柱(30咖X300mm)层析，用0. 01M—0. 30 NH4HC03进行梯度洗脱，自动收集 器分管收集，每管5ml，紫外254nm监控，收集两个峰尖部分洗脱液；在冷冻 干燥箱中按程序升温冷冻干燥25小时，所得冻干粉，即为MT自制纯品，含量 为95%以上。 分装按每支25mg分装。权利要求1、一种快速诱导提取猪肝金属硫蛋白的方法，其步骤是①、猪肝金属硫蛋白的诱导选用小猪，用含1500-2500ppm硫酸锌添加剂的仔猪饲料饲喂小猪4-6天，再用硫酸锌溶液腹腔注射，进行2-4次的剂量递增的诱导，每次剂量为50-150mg/kg体重；②、金属硫蛋白的检测诱导完1-3天后屠宰，并将所取新鲜肝脏样品直接按巯基显色法对金属硫蛋白的含量进行检测，同时将各样品冷冻温度控制在-18℃——22℃，10-15天后取出对金属硫蛋白含量进行再检测，每1g猪肝中提取的金属硫蛋白≥5mg；③、粗提将检测合格的新鲜猪肝脏捣碎，用Tris-HCl搅拌匀浆，倒入烧杯，再加入500mLTris-HCl和250mL乙醇-氯仿混合溶液，搅拌8-12分钟，低温离心10000r/min，4℃，20min，取上清液于另一离心管，放入78-82℃的水浴锅内水浴4-6min，取出后迅速冷却至室温，低温离心10000r/min，4℃，20min，离心后的上清液为金属硫蛋白粗提液，放置于4℃备用；④、纯化将粗提液经超滤浓缩，得浓缩液，在浓缩液中按体积比为1∶3于金属硫蛋白粗提液中加入乙醇放置过夜，取沉淀离心10000r/min，4℃，20min，离心后的沉淀用0.1mol/L的NH4HCO3溶液溶解至3倍体积，滤纸过滤，对滤液进行Sephedex G-100柱层析，在柱面加入MT显色试剂对MT组分着色；用0.1mol/LNH4HCO3进行洗脱，流速控制20mL/min，每5分钟收集1管，将收集的着色进行Sepharose Fast Flow柱层析，用0.01M-0.30NH4HCO3进行梯度洗脱，自动收集器分管收集，每管5ml，紫外254nm监控，收集两个峰尖洗脱液；在冷冻干燥箱中按程序升温冷冻干燥25小时，所得冻干粉。2、按权利要求1所述的一种猪肝金属硫蛋白的提取方法，其特征在于所 述的小猪选用5-10kg，关在笼内饲喂含2500ppm锌的饲料，连续饲喂4_6天， 用配制好的ZnS04.7H20溶液采用腹腔注射法进行诱导，每隔一天诱导一次，共 诱导2-4次，每次剂量分别为50mg/kg、 100mg/kg、 150mg/kg。全文摘要本发明公开了一种快速诱导猪肝金属硫蛋白的方法，其步骤是①诱导用锌添加剂的饲料饲喂小猪，再用ZnSO₄溶液采用腹腔注射法，进行剂量递增的诱导；②检测诱导完后屠宰，将所取新鲜肝脏样品直接按巯基显色法对金属硫蛋白的含量进行检测；③粗提将检测合格的新鲜猪肝脏捣碎，搅拌匀浆，倒入烧杯，再加入乙醇-氯仿混合溶液，低温离心，放人水浴锅内水浴，取出后冷却至室温，离心后的上清液即为金属硫蛋白粗提液；④纯化将粗提液经超滤浓缩，得浓缩液，在浓缩液中加入乙醇放置过夜，取沉淀离心，沉淀，对滤液层析，洗脱，收集，冷冻干燥，得冻干粉。本发明成本低，效果好，产量高，诱导剂来源广，MT自制纯品，含量为95％以上。文档编号C07K14/825GK101585879SQ200910062168公开日2009年11月25日 申请日期2009年5月19日 优先权日2009年5月19日发明者彬 张, 李丽立 申请人:中国科学院亚热带农业生态研究所