一种制备短裸甲藻毒素单克隆抗体的方法

专利名称：一种制备短裸甲藻毒素单克隆抗体的方法一种制备短裸甲藻毒素单克隆抗体的方法技术领域：本发明涉及免疫安全检测技术中单克隆抗体的制备，进一步讲涉及可 应用于水环境及水产品中短裸甲藻毒素单克隆抗体的制备。 [背景技术]水体富营养化致使藻类异常增殖，并释放生物毒素——藻毒素(Algae Toxin)，这些次级代谢产物严重危害了人类的用水安全和其他水生生物的 安全。其中导致神经系统麻痹的短裸甲藻毒素(Brevetoxins， BTX) 是毒 性较强，危害很大的一种藻类毒素。毒素通过食物链毒化鱼、贝等水生动 物，人类因摄食这些动物而发生中毒。BTX是由短裸甲藻属的双鞭甲藻(dinoflagellate)产生的具有独特药理 功能的梯型聚醚类化合物。BTX属神经性贝毒，与钠通道受体靶部位VI结 合。BTX为低熔点耐热固体，酯溶性，能溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、 乙醚、苯等有机溶剂和NaOH溶液，不易溶于中性和酸性水溶液。通常会 导致鱼群的大量死亡，其它动物摄食该藻类或被污染的鱼类后即可引起中 毒。中毒后会产生肠胃不适及神经系统症状如恶心、呕吐、腹泻、神经麻 木及冷热知觉的颠倒等，严重时会心律失常、窒息。该毒素除了通过食物 链引起中毒外，也可通过海洋中的气溶胶造成呼吸道急性中毒，中毒症状 为晕眩、瞳孔放大、气喘、干咳、流鼻涕及眼角膜炎等。BTX有10余种类 似物，由醚环串联而成。I型毒素是短裸甲藻产生的主要毒素。分子式为 C5()H7()014，分子量约为894。欧美等一些发达国家对冷藏鲜贝肉中的该毒素最高允许限量为0.8唯/g。目前，我国还没有BTX检测的国家标准，这不 仅影响到消费者的健康和生命安全，还会影响到水产品的出口。有关BTX的检测方法主要有(1)色谱分析法包括薄层色谱法(TLC) 和高效液相色谱(HPLC)法。TLC法主要用于BTX的分离和纯化。HPLC 法由于共流出物背景干扰，采用紫外检测在灵敏度和选择性方面较差，而 采用质谱(MS)检测，可提高选择性和灵敏度，检测限为0.9ng;采用高效液 相色谱/四极杆飞行时间质谱(HPLC/Q TOFMS)联用技术检测限可达到 0.5ng。缺点是样品预处理要求高；缺乏标准品，设备庞大、昂贵；需专业 人员。(2)组织培养法其基本原理是利用小鼠神经瘤细胞系易被毒素阻 断Na+通道这一特性检测毒素。当加入通道活化剂后，Na+离子过度内流， 造成细胞肿胀，甚至死亡。但加入了拮抗剂毒素，可使细胞存活，从而可 确定毒素的存在进而确定毒素的量。该方法的特点是灵敏、廉价、不需要 大量动物。缺点是缺乏特异性；对样品的处理要求高；要具有组织培养技 术和设备。免疫学检测法以其检测的稳定性、高灵敏性和速度快等优点在一些藻 类毒素检测中得以广泛应用。单克隆抗体的制备是建立免疫学检测方法的关键歩骤之一。但由于 BTX标准品价格昂贵、难以获得，至今国内外尚未见BTX单克隆抗体制备的报道。目前，单克隆抗体的制备多采用腹腔及皮下注射免疫方案。待被免疫 小鼠血清效价达4乂104以上后，取小鼠脾细胞与sp2/0细胞融合，有限稀释 法克隆，ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株，阳性细胞扩大培养后，小鼠腹水制备单克隆抗体。该方法已经是一项非常成熟的技术，广泛应用于食品及 环境免疫安全检测技术中单克隆抗体的制备。但是，传统方法制备单克隆抗体至少需要4次以上的免疫后才能进行细胞融合，至少需3.5个月以上的 时间才能生产出单克隆抗体；同时传统方法对抗原的需求量大， 一般需 200-475 pg/鼠。这大大地增加了单克隆抗体制备的成本，特别是对BTX等 价格昂贵的海洋生物毒素，制备一株单克隆抗体需要数万元人民币。发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种制备短裸甲藻毒素单克隆抗体 的方法，具有速度快，所需抗原量少的特点，从而有效降低单克隆抗体制 备的成本。本发明解决技术问题所采用的方案采用如下步骤 1.完全抗原的制备免疫抗原(BTX-IgG)和检测抗原(BTX-BSA)具体制备方法如下(1)混合液的制备取0.5mgBTX、 0.08mgN-羟丁二酰亚胺、0.15mg N, N双环乙烷碳二亚胺于0.5 mL DMF中混均，在10-30。C条件下孵育2h 制成混合液，并将混合液平均分成两等份；(2)载体蛋白反应液的制备 取0.4mg IgG溶于0.5 mL O.lmol/L NaHC03缓冲液中,混匀后做为载体蛋白 反应液；(3)将步骤(2)制备的载体蛋白反应液加入步骤(1)制备的混 合液中，在10-3(TC条件下孵育2h，所得产物为免疫抗原(BTX-IgG)，超滤 离心去除未反应的物质，分装后-2(TC保存备用；(4)取0.4mgBSA，溶 于0.5 mL O.lmol/LNaHC03缓冲液中，混匀后做为载体蛋白反应液；(5)将步骤(4)制备的载体蛋白反应液加入步骤(1)制备的混合液中，在10-30。C条件下孵育2h，所得产物为检测抗原(BTX-BSA)，超滤离心去除 未反应的物质，分装后-2(TC保存备用。2. 动物免疫(1) 免疫动物为8周龄雄性BALB/C小鼠，免疫前断尾采血作为阴 性血清；(2) 配制免疫抗原标准液2yg/iaL。首次免疫使用弗氏完全佐剂乳 化免疫抗原，抗原佐剂比l: 1，腹腔注射100uL/鼠。(3) 18天后采用脾 内注射法注射，具体方法如下将小鼠禁食禁水24小时，使用2%戊巴比 妥钠每只l()OuL将小鼠麻醉，待眨眼反射消失后，将小鼠俯卧固定于简 易操作台上，对背部皮毛消毒，在背部中线左侧0.5cm最后肋骨0.1cm处， 沿体中轴向下剪开lcm长切口，用手轻轻按压两侧腹壁，使脾脏暴露出腹 腔，使用lmL注射器，注射10 UL全抗原标准液，边注射边退针尽量使 其均匀注入脾内，小心将脾脏放回腹腔，逐层缝合腹腔及皮肤，首免21 天后断尾取血检测效价。3、 取血清效价大于104的被免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按 常规方法融合，制备单克隆抗体。采用本免疫方法所制备的单克隆抗体腹水效价可达2.4X105,亲和常 数达0.6X109 M人腹水抗体效价和亲和常数不低于传统免疫方法所得抗 体。本方案与传统方法相比，具有免疫速度快，至少节省30天的时间； 所需抗原量少(仅需要120pg/鼠)。从而有效地降低单克隆抗体制备的成本。具体实施方式免疫抗原(BTX-IgG)和检测抗原(BTX-BSA)具体制备 (1)混合液的制备取0.5mgBTX、 0.08mgN-羟丁二酰亚胺、0.15mg N, N双环乙烷碳二亚胺于0.5 mL DMF中混均，在10-3(TC条件下孵育2h 制成混合液，并将混合液平均分成两等份；(2)载体蛋白反应液的制备 取0.4mg IgG溶于0.5 mL O.lmol/L NaHC03缓冲液中，混匀后做为载体蛋白 反应液；(3)将步骤(2)制备的载体蛋白反应液加入步骤(1)制备的混 合液中，在10-3(TC条件下孵育2h，所得产物为免疫抗原(BTX-IgG)，超滤 离心去除未反应的物质，分装后-2(rC保存备用；(4)取0.4 mg BSA，溶 于0.5 mL0.1mol/LNaHCO3缓冲液中,混匀后做为载体蛋白反应液；(5)将 步骤(4)制备的载体蛋白反应液加入歩骤(1)制备的混合液中，在10-30 r条件下孵育2h，所得产物为检测抗原(BTX-BSA)，超滤离心去除未反应 的物质，分装后-20。C保存备用。试剂来源及SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备BTX为Express Technology Co., Ltd.产品；人IgG为Thermo产品；聚乙二醇(polythylene glycol-4000, PEG)、 RPMI1640培养基、HAT选择性培养基、牛血清白蛋白(BSA)、戊二醛、|3-巯基乙胺、福氏完全佐剂(FCA)、福氏不完全佐剂(FICA)、邻苯二胺(OPD) 、 N-羟丁 二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)、N， N双环乙烷碳二亚胺(N,N-dimethyformamide,DMF)等购自Sigma公司；离心超滤管为MILLPORE产品；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购于鼎国生物技术有限公司(北京)，甲醇、乙酸、碳酸钠、碳酸氢纳、ELISA所用化学试剂等为国产分析纯。在融合前15天复苏SP2/0骨髓瘤细胞并扩大培养。取出SP2/0细胞冻存管，立即放入装有40 。C水的保温桶内，轻轻晃动，直至动存液完全溶解，要在l-2min内完成。将动存液移到15mL离心管，加入5mL培养液，轻轻吹均匀，1000rpm， 5min，弃上清。用巴斯德吸管加入1管培养液，吹打均匀，移入50mL培养瓶内，再加入2吸管培养液，吹打均匀，分到2个新的50mL培养瓶内，这样就将一个冻存管细胞分到3个50mL培养瓶内。放于37。C含5。/。的二氧化碳培养箱中培养。24h后换液，每瓶4巴斯德管。48h后就可用于融合，在融合前24小时需要换液一次，使细胞在 融合时正处于对数分裂期。饲养细胞的制备取12周龄以上，与骨髓瘤同系小鼠l-2只。挖去-只眼球放血，待血 滴不出为止。拉颈处死，将鼠浸在75%酒精5min消毒。无菌条件下用消 毒镊子和剪刀剪开小鼠腹部外层皮肤(切勿将腹膜剪破而使腹腔内液体流 失)。然后向上下两侧方向拉开小鼠皮肤，暴露腹膜。用消毒注射器抽取 3mL无血清HT1640培养液，用镊子将腹膜提起，将溶液注入小鼠腹腔内。 一只手固定针筒，针头停留在腹腔内，轻轻按摩腹壁l-2min (使巨噬细胞 游出)，然后用注射器抽回腹腔内液体，并进行3次冲洗。收集冲洗液， 100()rpm离心5min，弃上清。用HAT培养液稀释离心沉淀的细胞，并调 整细胞浓度至1Xl()S个/mL。将细胞悬液按每孔l()O(il (约两滴)铺板。放 于37°C含5%的二氧化碳培养箱中培养。此细胞在融合前24h制备。免疫淋巴结B细胞悬液的制备将免疫的BALB/C小鼠摘眼取血致死，收集血液于EP管中，37°C放 置2h后离心分离血清，-20°C贮存备用。将猝死后小鼠浸入75%酒清中 3min。无菌取胭淋巴结，放入载有200目铜网的无菌平皿内。加2mL基础 培养基将淋巴结浸润，用胶棒将淋巴结研磨成浆状。巴斯德吸管吹打分散 细胞，转移至50mL玻璃离心管内，1000g/min离心5min，重复洗2次， 并计数细胞。最后用适量的RPMI-1640悬浮细胞，使成5X10々mL，体积 应为2mL以上。细胞融合及融合后细胞的培养将实施例5所得胭淋巴细胞与实施例3所得SP2/0细胞(细胞数之比 为10: 1)移到圆底玻璃离心管中，混均匀，1000rpm离心10min。弃掉上 清后，用手指稍用力弹击试管底部，使沉淀呈桨糊状。迅速滴入50%的PEG (约0.7mL)，用吸管轻轻吹吸4-5次，30s后，700rpm离心3min;缓慢 加入20mLRPMI-1640培养基(动作尽量轻柔)，然后使试管底部做划圆运 动；2min后1000g/min离心5min，弃上清，同法再洗一次；缓慢加入50mL 含HT培养基轻轻混匀后，加入到已准备好滋养细胞的96孔板上，每孔 加入IOO)liL融合细胞悬液，置于37°C 5%的C()2培养箱中培养。融合24 小时后，每孔补加50pL含HAT培养基。并分别于4天、7天和10天， 根据细胞生长情况更换或补加HAT培养基，第14、 18、 22、 25天换以20% 小牛血清HT培养基。在培养过程中，采用半量换液法，即每次从每个小 孔中吸出O.lmL培养液，再加入O.lmL新鲜培养液。杂交瘤细胞的筛选观察融合细胞的生长情况， 一般3天后可见克隆化生长的细胞，待融 合细胞集落生长至1/2视野(X100)以上时，就可检测上清液中的抗体， 筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞，并进行克隆。第一次检测抗体在第二次换 液的两天后，即融合后的第10天进行。以被测孔的OD值高于瘤细胞上清 液对照OD值的2倍以上定为阳性。阳性杂交瘤细胞的再克隆及扩大培养待阳性孔细胞接近长满时，用含20%胎牛血清的RPMI1640培养基将 细胞轻轻吹起，吸到无菌小瓶中，细胞计数，稀释至每10(^1中含有0.5-1个细胞密度。然后将稀释的细胞悬液滴入实施例4方法准备的词养细胞培养板内，每孔100pl。将板置入37。C含5。/。C02温箱培养，每天观察一次， 3天左右换液一次，观察每孔有几个克隆株，对有两个或没有细胞的孔分 别作出标记，待克隆细胞生长至8-l()天时，检测抗体，标出阳性孔，对所 有的克隆细胞孔换液，换液2天后，再检测，将两次检测OD值高的孔进 行对照，对两次检测都是阳性的孔再次克隆。直到克隆到所有的克隆细胞 孔都为阳性，最后选择OD值高、细胞活力好的杂交瘤细胞进行扩大培养。 [实施例9]腹水抗体的制备取8周龄BALB/C小鼠，将高压(113°C， 15min)灭菌的石蜡油注射 到小鼠腹腔，0.5mL/只，8d后腹腔注射实施例8所得杂交瘤细胞2X1()6/ 只，接种7d后每天观察小鼠腹水产生情况，如腹腔明显鼓起，小鼠行动困 难并且皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，将腹水3000rpm离心10 min,取上清，弃去脂肪，收集中间澄清腹水。采用辛酸-饱和硫酸铵法初歩 纯化,-20°C分装冻存备用。腹水抗体亲和力的测定纯化后腹水稀释至纯化前相同体积，同时以SP2/0细胞接种的腹水同 等稀释倍数做对照。采用非竞争性酶免疫法测定抗体亲和力。检测抗原 (BSA-BTX)按l、 0.5、 0.25、 0.125pg/ml包被酶标板，100pl/孔，37。C， 2h; 1%的明胶封闭后，将单抗从2000倍开始倍比稀释。以抗体浓度(mol/L) 的对数值为横座标，以其对应的OD值为纵座标，可在一个座标系内作出 4条S形曲线。找出S曲线的顶部，设定为ODmax。在曲线中分别找出4 条曲线各自50%ODmax对应的抗体浓度。将4个浓度两两一组，根据公 式计算单抗的亲和常数。Ka=(n-1 )/2(n[Ab、 ]t-[Ab]t)注n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab']t和[Ab]t分别为每组中两 t50。/。ODmax对应的抗体浓度(mol/L)， Ka为亲和常数。权利要求1、一种制备短裸甲藻毒素单克隆抗体的方法，其特征在于采用如下步骤完成1)完全抗原的制备免疫抗原(BTX-IgG)和检测抗原(BTX-BSA)具体制备方法如下(1)混合液的制备取0.5mg BTX、0.08mg N-羟丁二酰亚胺、0.15mg N，N双环乙烷碳二亚胺于0.5mL DMF中混均，在10-30℃条件下孵育2h制成混合液，并将混合液平均分成两等份；(2)载体蛋白反应液的制备取0.4mg IgG溶于0.5mL0.1mol/L NaHCO3缓冲液中，混匀后做为载体蛋白反应液；(3)将步骤(2)制备的载体蛋白反应液加入步骤(1)制备的混合液中，在10-30℃条件下孵育2h，所得产物为免疫抗原(BTX-IgG)，超滤离心去除未反应的物质，分装后-20℃保存备用；(4)取0.4mg BSA，溶于0.5mL0.1mol/L NaHCO3缓冲液中，混匀后做为载体蛋白反应液；(5)将步骤(4)制备的载体蛋白反应液加入步骤(1)制备的混合液中，在10-30℃条件下孵育2h，所得产物为检测抗原(BTX-BSA)，超滤离心去除未反应的物质，分装后-20℃保存备用；2)动物免疫(1)免疫动物为8周龄雄性BALB/C小鼠，免疫前断尾采血作为阴性血清；(2)配制免疫抗原标准液2μg/μL，首次免疫使用弗氏完全佐剂乳化免疫抗原，抗原佐剂比1∶1，腹腔注射100μL/鼠，(3)18天后采用脾内注射法注射，首免21天后断尾取血检测效价；3)取血清效价大于104的被免疫小鼠脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞按常规方法融合，制备单克隆抗体。2、根据权利要求1所述的的方法，其特征在于脾内注射方法 如下，将小鼠禁食禁水24小时，使用2%戊巴比妥钠每只100uL将 小鼠麻醉，待眨眼反射消失后，将小鼠俯卧固定于简易操作台上，对 背部皮毛消毒，在背部中线左侧0.5cm最后肋骨0.1cm处，沿体中轴 向下剪开lcm长切口，用手轻轻按压两侧腹壁，使脾脏暴露出腹腔， 使用lmL注射器，注射lOuL全抗原标准液，边注射边退针尽量使 其均匀注入脾内，将脾脏放回腹腔，逐层缝合腹腔及皮肤。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于饲养细胞的制备 是取12周龄以上，与骨髓瘤同系小鼠1-2只，挖去一只眼球放血， 待血滴不出为止，拉颈处死，将鼠浸在75。/。酒精5min消毒，无菌条 件下用消毒镊子和剪刀剪开小鼠腹部外层皮肤，然后向上下两侧方向 拉开小鼠皮肤，暴露腹膜，用消毒注射器抽取3mL无血清HT1640 培养液，用镊子将腹膜提起，将溶液注入小鼠腹腔内， 一只手固定针 筒，针头停留在腹腔内，轻轻按摩腹壁l-2min，使巨噬细胞游出，然 后用注射器抽回腹腔内液体，并进行3次冲洗，收集冲洗液，1000rpm 离心5min，弃上清，用HAT培养液稀释离心沉淀的细胞，并调整细 胞浓度至lXl()S个/mL，将细胞悬液按每孔10(^1铺板，放于37°C 含5%的二氧化碳培养箱中培养。此细胞在融合前24h制备。4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于免疫淋巴结B细胞悬液的制备是将免疫的BALB/C小鼠摘眼取血致死，收集血液于 EP管中，37。C放置2h后离心分离血清，-20。C贮存备用，将猝死后 小鼠浸入75%酒清中3min，无菌取胭淋巴结，放入载有200目铜网 的无菌平皿内，加2mL基础培养基将淋巴结浸润，用胶棒将淋巴结 研磨成浆状，巴斯德吸管吹打分散细胞，转移至50mL玻璃离心管内， 1000g/min离心5min，重复洗2次，并计数细胞，最后用适量的 RPMI-1640悬浮细胞，使成5 X 107/mL，体积为2mL以上。5、 根据权利要求1和4所述的方法，其特征在于细胞融合及 融合后细胞的培养是将胭淋巴细胞与SP2/0细胞，细胞数之比为10: 1，移到圆底玻璃离心管中，混均匀，1000rpm离心10min，弃掉上 清后，用手指稍用力弹击试管底部，使沉淀呈桨糊状，滴入50%的 PEG 0.7mL，用吸管吹吸4-5次，30s后，700rpm离心3min;缓慢 加入20mL RPMI-1640培养基，然后使试管底部做划圆运动；2min 后1000g/min离心5min，弃上清，同法再洗一次；缓慢加入50mL含 HT培养基轻轻混匀后，加入到已准备好滋养细胞的96孔板上，每孔 加入IO(VL融合细胞悬液，置于37°C 5%的C02培养箱中培养，融合 24小时后，每孔补加50pL含HAT培养基，并分别于4天、7天和 10天，根据细胞生长情况更换或补加HAT培养基，第14、 18、 22、 25天换以20%小牛血清HT培养基，在培养过程中，采用半量换液 法，即每次从每个小孔中吸出O.lmL培养液，再加入O.lmL新鲜培6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于杂交瘤细胞的筛 选是观察融合细胞的生长情况，3天后可见克隆化生长的细胞，待 融合细胞集落生长至1/2视野以上时，检测上清液中的抗体，筛选出 分泌抗体的杂交瘤细胞，并进行克隆，第一次检测抗体在第二次换液的两天后，即融合后的第10天进行，以被测孔的OD值高于瘤细胞 上清液对照OD值的2倍以上定为阳性。7、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于阳性杂交瘤细胞的再克隆及扩大培养是待阳性孔细胞接近长满时，用含20%胎牛血清 的RPMI1640培养基将细胞轻轻吹起，吸到无菌小瓶中，细胞计数， 稀释至每IO(VI中含有0.5-1个细胞密度，然后将稀释的细胞悬液滴 入饲养细胞培养板内，每孔10(^1。将板置入37。C含5。/。C02温箱培 养，每天观察一次，3天换液一次，观察每孔有几个克隆株，对有两 个或没有细胞的孔分别作出标记，待克隆细胞生长至8-10天时，检 测抗体，标出阳性孔，对所有的克隆细胞孔换液，换液2天后，再检 测，将两次检测OD值高的孔进行对照，对两次检测都是阳性的孔再 次克隆，直到克隆到所有的克隆细胞孔都为阳性，最后选择OD值高、 细胞活力好的杂交瘤细胞进行扩大培养。8、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于腹水抗体的制备 是取8周龄BALB/C小鼠，将113°C、 15min条件高压灭菌的石蜡油 注射到小鼠腹腔，0.5mL/只，8天后腹腔注射杂交瘤细胞2 X 106/只，接 种7天后每天观察小鼠腹水产生情况，如腹腔明显鼓起，小鼠行动困 难并且皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，将腹水3000rpm离心10min,取上清，弃去脂肪，收集中间澄清腹水，采用辛酸-饱和硫酸 铵法初步纯化,-20°C分装冻存备用。9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于腹水抗体亲和力 的测定是纯化后腹水稀释至纯化前相同体积，同时以SP2/0细胞接种 的腹水同等稀释倍数做对照，采用非竞争性酶免疫法测定抗体亲和 力，检测抗原BSA-BTX按1、 0.5、 0.25、 0.125吗/ml包被酶标板， 100M1/ L， 37°C， 2h; 1%的明胶封闭后，将单抗从2000倍开始倍比 稀释，以抗体浓度mol/L的对数值为横座标，以其对应的OD值为纵 座标，在一个座标系内作出4条S形曲线，找出S曲线的顶部，设定 为ODmax，在曲线中分别找出4条曲线各自50%ODmax对应的抗体 浓度，将4个浓度两两-一组，根据公式计算单抗的亲和常数。全文摘要一种制备短裸甲藻毒素单克隆抗体的方法涉及免疫安全检测技术中单克隆抗体的制备，采用如下步骤完成，(1)完全抗原的制备，包括免疫抗原(BTX-IgG)和检测抗原(BTX-BSA)制备，(2)动物免疫，(3)取血清效价大于10⁴的被免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法融合，制备单克隆抗体。用本免疫方法所制备的单克隆抗体腹水效价可达2.4×10⁵，亲和常数达0.6×10⁹M^-1，腹水抗体效价和亲和常数不低于传统免疫方法所得抗体，免疫速度快，从而有效地降低单克隆抗体制备的成本。文档编号C07K16/14GK101509031SQ200910066698公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月27日 优先权日2009年3月27日发明者任洪林, 卢士英, 玉 周, 张媛媛, 李岩松, 柳增善, 潘风光 申请人:吉林大学