从含蛋白质的溶液中分离细菌脂多糖的方法

专利名称：：从含蛋白质的溶液中分离细菌脂多糖的方法技术领域：：本发明涉及从含蛋白质的溶液中分离细菌脂多糖的方法，并涉及脂多糖的检测方法。众所周知，细菌脂多糖(LPS)被认为是内毒素，在给动物和人使用时可以引起(严重的)热源反应。因此，已认识到LPS引起的休克、发烧、白细胞减少、高血糖、血管内血凝固以及其它生物效应。为此，当高于某一阈浓度的LPS时，将不准许药品或生物制品给动物和人使用。在溶液中，LPS按双层方式排列，类似于磷脂的双层。二价阳离子例如Ca++能稳定所述双层。这些庞大的双层结构的大小可以通过使用洗涤剂或胆汁盐来降低。由此形成的LPS和洗涤剂或胆汁盐的混合胶束的分子量较小，这提供了用超滤法(ultrafiltration)或微量过滤法(microfiltration)将所述胶束结合LPS从产品中分出来的可能。利用细菌LPS的基本特性，还有一些其它方法被描述用来从感兴趣的产品中除去LPS。其中有方法利用有机物质例如苯酚、三氯乙酸或苯酚/氯仿/石油醚混合物或用内毒素结合蛋白(ENP)中和LPS。后一个方法适宜于实验室规模除去LPS，但蛋白质明显损失。此外，LPS已通过利用树脂、荷电过滤器(chargedfilters)、硫酸钡、洗涤剂和胆汁酸或其衍生物来去除(参见例如美国专利4315919和Sweadner等人，Appl.andEnv.Microbiology34，1977，382-385)，它们与或不与螯合剂合用。尽管上述方法在实验室规模能不同程度地从含蛋白质的溶液中去除LPS，但这些方法均不适于在工业规模上以低成本和高效率的方式从这样的溶液中分离LPS。本发明的目的是提供从含蛋白质的溶液中去除LPS的简单而可靠的方法，该方法完全可以在工业上使用。在一些场合需要定量或定性测定溶液中细菌LPS的诊断方法(LAL试验)。用于该目的经典试验是凝胶凝块试验(gelclottest)和有关的显色试验。但为了准确，这两个试验对反应条件的要求高。因此常常难于得出结果，尤其是在LPS浓度在低的检测范围内的时候，因此，本发明的另一个目的是提供对溶液、特别是含干扰化合物的溶液中的LPS进行检测和/或定量的方法。已出人意料的发现，采用下述方法可将LPS高效率地从含蛋白质的溶液中分离出来，即将至少一种合适的增溶剂加到所述溶液中并使该溶液与玻璃表面接触，然后从该含量蛋白质的溶液中分离载有LPS的玻璃表面。本发明的方法能从含水溶性蛋白质以及膜结合蛋白质的溶液中基本上去除LPS。业已证明，本发明方法特别适于从LPS严重污染的含蛋白质的溶液中除去LPS。本发明方法非常简便，可容易地应用到工业上。用在本发明方法中的适宜增溶剂是洗涤剂，这样的洗涤剂包括非离子和离子表面活性物质两者。非离子表面活性物质也包括胆汁酸盐，例如胆酸盐，离子表面活性物质也包括具有偶极离子结构的物质。所选择的增溶剂应不影响含蛋白质溶液所需的生物活性。玻璃表面应理解为也包括透明的表面，即透明材料如陶瓷材料的表面，但优选玻璃，特别是常规未预处理的玻璃。用在本发明中的玻璃表面的适宜例子有玻璃珠、小玻璃瓶、玻璃管、玻璃片和玻璃滤器。本发明方法优选根据含蛋白质溶液的组成及其成分特别是蛋白质或者蛋白质和/或污染LPS的特性在某些有利的条件下进行。所选择的条件应不影响含蛋白质溶液的所需的生物活性。优选使用低离子强度基本上是水的溶液。在处理期间，溶液的温度不十分严格，但一般约室温是很合适的。优选溶液具有足够高的pH，例如在约8-9.5的范围内。pH可以通过加适当的缓冲剂如磷酸盐缓冲剂、HEPES缓冲剂或TRIS缓冲剂来调节。尽管所述溶液可以用所述玻璃表面处理(培养)过夜，但培养时间一般少于1小时，甚至大约10分钟就已经足够了。此外，按照本发明的另一个方面，通过结合到玻璃表面而从溶液中分离出的LPS的量可以例如采用商品凝胶凝块试验或显色试验成套仪器在该仪器供应厂商推荐的反应的条件下来准确地检测和测定。因此，本发明方法具有广泛的用途，其使用范围从实验室应用到无LPS的生物制品的生产。例如，来自动物的蛋白质(例如白蛋白)常常是LPS污染的，可将其在进一步使用例如作为组织培养成分前纯化。因此为临床或实验作为组织培养成分前纯化。因此为临床或实验室的目的而指定的单克隆抗体、治疗蛋白质、酶、病毒疫苗和细菌疫苗通讯生物反应调节剂(生长因子等)可以从例如来自组织培养介质或细菌的细胞壁或来自培养后处理的LPS污染中纯化得到。例如卵诱导的(egg-derived)疫苗如灭活的疫苗可被容易地消除污染。本发明可以进一步解释如下首先使LPS游离，并优选在前述有利的条件下采用下述方法使其成为小胶束一部分添加至少一种增溶剂，一般是洗涤剂，或者使用几种增溶剂，例如洗涤剂与螯合剂合用。适宜的金属离子螯合剂是多(乙酸化胺)，例如EDTA、DTPA等，以及可任选的羟基化多酸，例如柠檬酸、草酸、酒石酸等，以及它们的碱金属盐。优选使用形成小胶束且因而可被容易地从基本上是水的溶液中去除的洗涤剂，例如胆酸盐(例如去氧胆酸盐(DOC)或其类似物)。于是LPS通过吸附至适宜的玻璃表面而被从本体溶液中去除，载有LPS的玻璃表面接着被去除，下一步，可以例如通过(透析)(dia)过滤或与树脂(例如Amberlite)结合将洗涤剂除去。得到的蛋白质溶液几乎完全没有LPS。已发现，玻璃表面，例如以玻璃珠(例如直径5mm，表面74.2mm2)形成的玻璃表面结合至少10μgLPS或≥105EU(＝用LAL试验测定的内毒素单位，lngLPS＝约10EU)。洗涤剂DOC可以容易地通过用截留值(cut-offvalue)至少为30或50Kd的膜超滤被容易地除去。若采用合适的熟知的用于除去洗涤剂的方法和材料，蛋白质的回收率≥95%是可能的。由从含血细胞凝集素的溶液去除内毒素获得了有说服力的数据;参见实施例。在除去洗涤剂之前用蛋白质法和采用单一辐射扩散(singleRadialDiffusion)法的免疫化学测定法测定，所述病毒膜蛋白的回收率为100%，这表明未能检测到由于吸附到玻璃上造成的蛋白质损失。本发明用以下具体实施例更详细地加以说明。实施例1在实施例中，采用下述通法。将下列物质混合并溶于水来制备磷酸盐缓冲溶液EDTA·2Na(1860mg/l)，NaCl(877.5mg/l)，Na2HPO4(710mg/l)。通过加入0.5mol/lNaOH将pH调至9.5。通过按上述相同方法将10%(V/V)脱氧胆酸盐(DOC)的水溶液调至pH9.5来制备脱氧胆酸储液。其它的洗涤剂储液按相应的方法来制备。将含蛋白质例如被细菌LPS严重污染(例如大约300000EU/ml)的流感血细胞凝集素起始溶液用9体积上述缓冲溶液稀释。得到的蛋白质浓度为125μg/ml。将DOC储液加至终浓度为1%，并将混合物于20℃培养至少1小时。所有实验均在不锈钢管中进行。然后加入玻璃珠(直径5mm，表面74.2mm)。将混合物于20℃轻轻地回荡过夜。然后用LAL试验法测定未结合到所述玻璃珠上的游离内毒素的量。欲加玻璃的最小量可以由原LPS含量和上面得到的信息来计算。过量的玻璃不影响LPS的去除。通过将溶液转移至另一容器中而将溶液与玻璃珠分离可以获得几乎没有LPS的蛋白质溶液(例如0.5-50EU/ml)。玻璃结合LPS的量可以通过显色试验法来检测。在以上低离子强度和pH7以上的条件下，DOC可容易地通过超滤例如用适宜分子量截留值(MWCO)的过滤器来去除。显然，所用过滤器的选择主要取决于感兴趣的蛋白质的大小和洗涤剂胶束的大小。例如用MWCO50Kd的膜以所需的缓冲剂透析过滤可有效地从流感血细胞凝集素制剂中除去DOC。或者，可将DOC与适宜的树脂(例如AmberliteXAD-4)结合。各种洗涤剂的使用在以上通法的条件下用2颗玻璃珠在各种洗涤剂存在下处理含流感血细胞凝集素(HA-蛋白质)被内毒素严重污染(自大肠杆菌(E.coli)0111/B4的外膜)的溶液。使用的洗涤剂是脱氧胆酸盐(DOC)、正辛基葡糖甙(N-oct-gl.)、十六烷基三甲基铵溴化物(CTAB)和TritonX100。得到下列结果<tablesid="table1"num="001"><tablealign="center">洗涤剂浓度细菌LPS---N-oct.-glCTABTriton×100DOC0%1%1%1%1%96,000EU/ml＜3,000EU/ml＜1,500EU/ml＜1,500EU/ml＜50EU/ml</table></tables>实施例Ⅱ洗涤剂浓度的变化在实施例1所述的相同条件下试验各洗涤剂浓度。在本实施例中使用HA-蛋白质，所得结果如下<tablesid="table2"num="002"><tablealign="center">洗涤剂浓度细菌LPS---DOCDOC0%0.5%1%96,000EU/ml3,000EU/ml＜300EU/ml</table></tables>实施例Ⅲ蛋白质的变化在实施例1所述的相同条件下，将本发明方法用于各种蛋白质的去污染。所用蛋白质如下血细胞凝集素(HA)、牛血清白蛋白(BSA)和兔免疫球蛋白(ⅠgG)。所得结果如下<tablesid="table3"num="003"><tablealign="center">洗涤剂浓度蛋白质细菌LPS---DOCDOCDOC0%1%1%1%HA+BSA+lgGHABSAlgG6,000EU/ml＜50EU/ml＜300EU/ml＜1,500EU/ml</table></tables>实施例Ⅳ内毒素污染的改变在实施例1所述的相同条件下，用本发明方法研究被各种内毒素污染的HA-蛋白质，所述内毒有大肠肝菌0111∶B4，明尼苏达沙门氏菌Re595(Re突变体)和绿脓假单胞菌10。所得结果如下>实施例Ⅴ玻璃表面的存在与否将4ml内毒素严重污染的HA-蛋白质(125μg/ml)、0%或1.1%DOC和磷酸盐缓冲剂的溶液在实施例1所述的相同条件下以及有或无玻璃珠存在的情况下进行处理。所得结果如下<<p>用明尼苏达沙门氏菌污染的HA蛋白质进行相应的试验，结果如下权利要求1.从含蛋白质溶液中分离细菌脂多糖(LPS)的方法，其中所述LPS通过使用至少一种合适的增溶剂被释入所述溶液，所述方法的特征在于使所述溶液与玻璃表面接解，然后从所述含蛋白质溶液中分离出载有LPS的玻璃表面。2.按照权利要求1的方法，其特征在于LPS通过加入适当的洗涤剂来释放。3.按照权利要求1的方法，其特征在于LPS通过加入适当的洗涤剂和金属离子螯合剂的混合物来释放。4.按照权利要求2或3的方法，其特征在于去氧胆酸盐或其类似物被用作洗涤剂。5.按照权利要求2、3或4的方法，其特征在于该方法在低离子强度且pH在约8-9.5范围内的基本上是水的溶液中实施。6.按照权利要求1至5之任一的方法，其特征在于将LPS释入溶液中的试剂在去除载有LPS的玻璃表面后被从所述含蛋白质溶液中去除。7.在溶液中测定细菌LPS的方法，其特征在于使LPS结合至玻璃表面，接着分离载有LPS的玻璃表面，然后用本身已知的方法测定结合至玻璃表面的LPS的量。全文摘要本发明涉及从含蛋白质溶液中分离细菌脂多糖(LPS)的方法，其中LPS通过使用至少一种合适的增溶剂被释入到所述溶液中，并使所述溶液与玻璃表面接触，然后从所述含蛋白质溶液中分离出载有LPS的玻璃表面。此外，按照本发明方法，溶液中的LPS可以容易地通过常规方法，通过首先使所述LPS按上述方法结合到玻璃表面来检测。文档编号C07K1/14GK1106021SQ9410816公开日1995年8月2日申请日期1994年7月22日优先权日1993年7月26日发明者R·康皮埃,J·B·施卢特哈克,G·J·M·范沙伦堡,B·C·布雷施奈德,R·布兰斯申请人:杜法尔国际研究公司