一种比色/荧光双模检测乙酰胆碱酯酶和/或有机磷农药的方法

本发明属于分析检测领域，涉及一种基于比色/荧光双模检测乙酰胆碱酯酶和/或有机磷农药的方法，更具体地，涉及一种基于具有高氧化酶活性的纳米酶bsa-ceo2 ncs的高灵敏比色/荧光双模传感器检测乙酰胆碱酯酶和/或有机磷农药的方法。

背景技术：

1、乙酰胆碱酯酶(ache)可将乙酰硫代胆碱(atch)水解为硫代胆碱(tch)，起到控制atch水平的重要作用。研究表明，atch失衡可导致多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默症、帕金森病和重症肌无力。因此，监测乙酰胆碱酯酶水平和筛选潜在的乙酰胆碱酯酶抑制剂是非常重要的。

2、近年来，有机磷农药(ops)的滥用已经造成了严重的生态和人类健康问题。此外，ops不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶，引起atch的异常积累，导致各种疾病，最终死亡。目前，大多数农药残留检测方法(如高效液相色谱法、表面增强拉曼光谱法、电化学法等)都需要昂贵的仪器和复杂的操作，无法实现快速实时检测。因此，设计一种可靠的现场检测食品和环境中有机磷农药残留的方法势在必行。

3、近年来，纳米酶因其高稳定性、可修饰的催化活性和低廉的成本受到越来越多的关注。然而，目前大多数基于纳米酶的传感器仅限于单模检测，存在假阳性的缺点。双模传感器不仅具有固有的自校准和自验证能力，而且可以满足不同检测条件的要求，具有更可靠的检测结果。纳米团簇作为常见的荧光材料，近年来被报道表现出类似酶的催化活性，成为潜在的双功能纳米酶。然而，很少有研究将ncs的酶催化特性与其荧光特性结合起来，实现对分析物的多模态传感。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有检测方法灵敏度低、检测耗时、成本过高以及步骤繁琐的缺点，采用掺杂牛血清白蛋白(bsa)的方法合成了一种新的纳米酶bsa-ceo2 ncs，令人惊讶的是，bsa-ceo2 ncs具有良好的荧光性质和类似氧化酶的性质，可以满足荧光和紫外(uv)检测的要求。发明人利用双功能纳米酶bsa-ceo2 ncs建立了比色和荧光传感系统，并将这种新型双模分析系统用于检测乙酰胆碱酯酶和有机磷农药。本发明提供了一种基于具有氧化酶活性的bsa-ceo2 ncs的高灵敏比色/荧光双模传感器检测乙酰胆碱酯酶和/或有机磷农药的方法，该方法能够实现对乙酰胆碱酯酶和/或有机磷农药的简单快速、直观、高灵敏的检测。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs，它是采用bsa孵育策略合成的，具体为：将牛血清白蛋白(bsa)溶解于去离子水中，加入ce3+溶液，调节反应体系的ph至7～12，搅拌反应、干燥制得的。

4、所述的牛血清白蛋白(bsa)和去离子水的质量体积比为50:50～300:50mg/ml，优选为100:50～150:50mg/ml。

5、所述的ce3+溶液是用去离子水配制的(ch3coo)3ce·4h2o溶液；所述的(ch3coo)3ce·xh2o的浓度为10～100mg/ml，优选为20～50mg/ml。

6、所述的bsa和(ch3coo)3ce·4h2o的质量比为1:1～6:1，优选为2:1～4:1，最优选为3:1。

7、优选的，调节反应体系的ph至10～11。

8、所述的反应的时间为3～10h，优选为5～7h。

9、所述的干燥为冷冻干燥。冷冻干燥的温度一般为-30～-50℃。

10、一种比色/荧光双模检测乙酰胆碱酯酶和/或有机磷农药的方法，包括如下步骤：

11、步骤(a)、合成双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs；

12、步骤(b)、构建乙酰胆碱酯酶(ache)比色传感器：硫代乙酰胆碱(atch)和不同浓度的ache、第一反应溶剂进行第一步孵育反应，得到反应液a；将双功能纳米材料bsa-ceo2ncs、邻苯二胺(opd)和反应液a、第二反应溶剂混合，进行第二步孵育反应，反应结束后，在波长350～550nm下测量样品的紫外吸收曲线，以样品中ache的终浓度为横坐标，以450nm处的最大紫外吸收值为纵坐标，建立ache紫外标准曲线；

13、步骤(c)、构建乙酰胆碱酯酶(ache)荧光传感器：硫代乙酰胆碱(atch)和不同浓度的ache、第一反应溶剂进行第一步孵育反应，得到反应液a；将双功能纳米材料bsa-ceo2ncs、邻苯二胺和反应液a、第二反应溶剂混合，进行第二步孵育反应，反应结束后，在波长400～650nm下测量样品的荧光曲线，以样品中ache的终浓度为横坐标，以440nm处的荧光值与570nm处荧光值的比值f440/f570为纵坐标，建立ache荧光标准曲线；

14、步骤(d)、样品检测：按照步骤(b)测得未知ache浓度的待测样品的最大紫外吸收值，代入步骤(b)的ache紫外标准曲线，得到待测样品中ache浓度；

15、按照步骤(c)测得未知ache浓度的待测样品的荧光比值f440/f570，代入步骤(c)的ache荧光标准曲线，得到待测样品中ache浓度。

16、步骤(b)中，第一反应溶剂为ph 6.0～9.0tris-hcl缓冲液，优选为ph 7.4、50mmtris-hcl缓冲液。

17、第一步孵育反应的温度为30～55℃，优选为37℃；第一步孵育反应的时间为10～60分钟，优选为30分钟。

18、双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs、邻苯二胺和反应液a、第二反应溶剂混合后，opd的终浓度为1.5～2mm，优选为1.67nm；atch的终浓度为0.2mm；ache的终浓度为0.1～25mu/ml，具体的，ache的终浓度分别为0.1mu/ml、0.5mu/ml、1mu/ml、2mu/ml、3mu/ml、5mu/ml、10mu/ml、15mu/ml、20mu/ml、25mu/ml；bsa-ceo2ncs的终浓度为1～50μg/ml，优选为5μg/ml。

19、优选的，用超纯水分别配制双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液、邻苯二胺溶液，将50μl双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液、50μl邻苯二胺溶液和50μl反应液a、150μl第二反应溶剂混合。

20、第二反应溶剂为ph 3.0～4.0醋酸-醋酸钠缓冲液，优选为ph 4.0、0.2m醋酸-醋酸钠缓冲液。

21、第二步孵育反应的温度为30～55℃，优选为37℃；第二步孵育反应的时间为10～60分钟，优选为30分钟。

22、步骤(c)中，第一反应溶剂为ph 6.0～9.0tris-hcl缓冲液，优选为ph 7.4、50mmtris-hcl缓冲液。

23、第一步孵育反应的温度为30～55℃，优选为37℃；第一步孵育反应的时间为10～60分钟，优选为30分钟。

24、双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs、邻苯二胺和反应液a、第二反应溶剂混合后，opd的终浓度为1.5～2mm，优选为1.67nm；atch的终浓度为0.2mm；ache的终浓度为0.1～25mu/ml，具体的，ache的终浓度分别为0.1mu/ml、0.5mu/ml、1mu/ml、2mu/ml、3mu/ml、5mu/ml、10mu/ml、15mu/ml、20mu/ml、25mu/ml；bsa-ceo2ncs的终浓度为1～50μg/ml，优选为5μg/ml。

25、优选的，用超纯水分别配制双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液、邻苯二胺溶液，将50μl双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液、50μl邻苯二胺溶液和50μl反应液a、150μl第二反应溶剂混合。

26、第二反应溶剂为ph 3.0～4.0醋酸-醋酸钠缓冲液，优选为ph 4.0、0.2m醋酸-醋酸钠缓冲液。

27、第二步孵育反应的温度为30～55℃，优选为37℃；第二步孵育反应的时间为10～60分钟，优选为30分钟。

28、步骤(b)和步骤(c)中的第一反应溶剂可以相同，步骤(b)和步骤(c)中的第二反应溶剂可以相同，步骤(b)和步骤(c)中的第一孵育反应的条件可以相同，步骤(b)和步骤(c)中的第二孵育反应的条件可以相同。

29、步骤(d)中，按照步骤(b)测得待测样品的最大紫外吸收值：硫代乙酰胆碱(atch)和待测样品、第一反应溶剂进行第一步孵育反应，得到反应液a；将双功能纳米材料bsa-ceo2ncs、邻苯二胺和反应液a、第二反应溶剂混合，进行第二步孵育反应，反应结束后，在波长350～550nm下测量样品的紫外吸收曲线，获得450nm处的最大紫外吸收值。

30、优选的，将450nm处的最大紫外吸收值代入步骤(b)的ache紫外标准曲线，再根据待测样品的稀释倍数换算得到待测样品中ache浓度。

31、按照步骤(c)测得待测样品的荧光比值f440/f570：硫代乙酰胆碱(atch)和待测样品、第一反应溶剂进行第一步孵育反应，得到反应液a；将双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs、邻苯二胺和反应液a、第二反应溶剂混合，进行第二步孵育反应，反应结束后，在波长400～650nm下测量样品的荧光曲线，获得荧光比值f440/f570。

32、优选的，将f440/f570代入步骤(c)的ache荧光标准曲线，再根据待测样品的稀释倍数换算得到待测样品中ache浓度。

33、作为本发明所述的比色/荧光双模检测乙酰胆碱酯酶和/或有机磷农药的方法的优选技术方案，还包括有机磷农药的比色/荧光检测，包括：

34、步骤(e)、构建有机磷农药(ops)比色传感器：atch、ache和不同浓度的ops、第一反应溶剂进行第一步孵育反应，得到反应液b；将双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs、邻苯二胺和反应液b、第二反应溶剂混合，进行第二步孵育反应，反应结束后，在波长350～550nm下测量样品的紫外吸收曲线，以样品中ops的终浓度的ln值为横坐标，以450nm处的最大紫外吸收值为纵坐标，建立ops紫外标准曲线；

35、步骤(f)、构建有机磷农药(ops)荧光传感器：atch、ache和不同浓度的ops、第一反应溶剂进行第一步孵育反应，得到反应液b；将双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs、邻苯二胺和反应液b、第二反应溶剂混合，进行第二步孵育反应，反应结束后，在波长400～650nm下测量样品的荧光曲线，以样品中ops的终浓度的ln值为横坐标，以570nm处的荧光值与440nm处荧光值的比值f570/f440为纵坐标，建立ops荧光标准曲线；

36、步骤(g)、样品检测：按照步骤(e)测得未知ops浓度的待测样品的最大紫外吸收值，代入步骤(e)的ops紫外标准曲线，得到待测样品中ops浓度；

37、按照步骤(f)测得未知ops浓度的待测样品的荧光比值f570/f440，代入步骤(f)的ops荧光标准曲线，得到待测样品中ops浓度。

38、步骤(e)中，第一反应溶剂为ph 7.4、50mm tris-hcl缓冲液；第一步孵育反应的温度为37℃，第一步孵育反应的时间为30分钟。

39、双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs、邻苯二胺和反应液b、第二反应溶剂混合后，ops的终浓度为0.001～6μg/ml，具体的，ops的终浓度分别为0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、5μg/ml、6μg/ml；ache的终浓度为25mu/ml；opd的终浓度为1.5～2mm，优选为1.67mm；atch的终浓度为0.2mm；ache的终浓度为0.1～25mu/ml，优选为25mu/ml；bsa-ceo2 ncs的终浓度为1～50μg/ml，优选为5μg/ml。

40、优选的，用超纯水分别配制双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液、邻苯二胺溶液，将50μl双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液、50μl邻苯二胺溶液和50μl反应液b、150μl第二反应溶剂混合。

41、第二反应溶剂为ph 4.0、0.2m醋酸-醋酸钠缓冲液；第二步孵育反应的温度为37℃，第二步孵育反应的时间为30分钟。

42、步骤(f)中，第一步反应溶剂为ph 7.4、50mm tris-hcl缓冲液，第一步孵育反应的温度为37℃，第一步孵育反应的时间为30分钟。

43、双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs、邻苯二胺和反应液b、第二反应溶剂混合后，ops的终浓度为0.001～6μg/ml，具体的，ops的终浓度分别为0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、5μg/ml、6μg/ml；ache的终浓度为25mu/ml；opd的终浓度为1.5～2mm，优选为1.67mm；atch的终浓度为0.2mm；ache的终浓度为0.1～25mu/ml，优选为25mu/ml；bsa-ceo2 ncs的终浓度为1～50μg/ml，优选为5μg/ml。

44、优选的，用超纯水分别配制双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液、邻苯二胺溶液，将50μl双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液、50μl邻苯二胺溶液和50μl反应液b、150μl第二反应溶剂混合。

45、第二反应溶剂为ph 4.0、0.2m醋酸-醋酸钠缓冲液；第二步孵育反应的温度为37℃，第二步孵育反应的时间为30分钟。

46、作为本发明所述的比色/荧光双模检测乙酰胆碱酯酶和/或有机磷农药的方法的优选技术方案，还包括：

47、步骤(h)、构建水凝胶传感器：将双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液、tmb溶液、ph＝4、0.2m的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和海藻酸钠混合，37℃孵育10min；再加入cacl2和聚丙烯酸的混合溶液，37℃震摇，得到水凝胶传感器；

48、步骤(i)、ache、atch、不同浓度的有机磷农药和ph 7.4、50mm的tris-hcl缓冲液混合，37℃孵育30分钟，得到反应溶液；将反应溶液滴入水凝胶传感器中，超声室温反应10分钟，用智能手机上的颜色识别应用程序“rgb color detector”记录rgb值；以有机磷农药的浓度为横坐标、以蓝通道/红通道的比值b/r为纵坐标，建立ops标准曲线；

49、步骤(j)、按照步骤(i)处理未知有机磷农药浓度的待测样品，若水凝胶传感器呈蓝色，说明待测样品含有有机磷农药；按照步骤(i)测得未知有机磷农药浓度的待测样品的rgb数值，获得蓝通道/红通道的比值b/r，将b/r代入步骤(i)的ops标准曲线，得到待测样品中有机磷农药浓度。

50、步骤(h)中，优选的，所述的双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液是用超纯水配制的，浓度为30μg/ml。

51、优选的，所述的tmb溶液是用超纯水配制的，浓度为10mm。

52、优选的，所述的cacl2溶液是用超纯水配制的，浓度为60mm。

53、优选的，所述的聚丙烯酸是用超纯水配制的，浓度为5mm。

54、优选的，将双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs溶液、tmb溶液、ph＝4、0.2m的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和海藻酸钠混合，总体积为200μl，tmb的终浓度为2.5mm，bsa-ceo2 ncs的终浓度为5μg/ml，海藻酸钠终浓度50mg/ml，37℃孵育10min；再加入10μl cacl2溶液和10μl聚丙烯酸溶液的混合溶液，37℃震摇，得到水凝胶传感器。

55、步骤(i)中，ache、atch、不同浓度的有机磷农药和ph 7.4、50mm的tris-hcl缓冲液混合后，ache的终浓度为25mu/ml，atch的终浓度0.2mm，有机磷农药的终浓度为0.1～40μg/ml，具体的，有机磷农药的分别为0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml。

56、步骤(j)中，按照步骤(i)将ache、atch、未知有机磷农药浓度的待测样品和ph7.4、50mm的tris-hcl缓冲液混合，37℃孵育30分钟，得到反应溶液，将反应溶液滴入水凝胶传感器中，超声室温反应10分钟，若水凝胶传感器呈蓝色，说明待测样品含有有机磷农药，随着有机磷农药浓度的升高，水凝胶颜色呈现从浅蓝到深蓝色的变化趋势。

57、所述的有机磷农药为毒死蜱、灭线磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷。

58、所述的待测样品为食品样本、环境样本；所述的食品样本可以为水果；所述的环境样本可以为河水、湖水。

59、所述的待测样品先进行预处理，再进行样品检测。

60、所述的待测样品为食品样本时，预处理为：食品样本用蒸馏水清洗以去除外部杂质、切碎，按照切碎的食品样本和无水乙醇料液比为1:5～1:40g/ml混合，超声提取2～6h，提取液以转速8000～16000rpm离心5～20分钟，取上清，用0.45μm膜过滤，得到待测样品溶液。其中，超声提取的超声功率为300w。

61、所述的待测样品为环境样本时，预处理为：环境样本以转速8000～16000rpm离心5～20分钟，取上清，用0.45μm膜过滤，得到待测样品溶液。

62、本发明方法的检测机理为(图1)：bsa-ceo2 ncs既具有荧光性能，又可以发挥氧化酶活性，催化无色的邻苯二胺(opd)氧化生成黄色的2,3-二氨基吩嗪(dap)，在450nm处产生紫外信号；而ache可以催化atch生成带有巯基的tch，具有还性的tch会抑制dap的生成，使紫外信号减弱，而在ops存在时，ache酶活性被抑制，dap紫外信号恢复，从而实现比色检测。而bsa-ceo2 ncs本身具有荧光(发射峰在440nm)，其荧光发射与dap的紫外吸收重叠，产生fret效应，使ncs本身荧光减弱，而dap荧光增强(发射峰在570nm)；当ache与atch存在时，随着dap生成减少，则f570降低，f440增强；当ops存在时，dap生成恢复，则代表dap的f570增加，ncs本身荧光f440降低，从而可以实现比率荧光检测。

63、与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

64、1、纳米材料bsa-ceo2 ncs的合成方法简便、绿色。

65、2、纳米材料bsa-ceo2 ncs不仅具有荧光性质，还具有良好的氧化酶活性。

66、3、本发明利用双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs实现双模检测双目标物。双模式策略不仅为实际检测需求提供了多种方法，还可以实现定量测定结果的相互验证，提高数据的可靠性。

67、4、双功能纳米材料bsa-ceo2 ncs因其优异的稳定性，增加了双模传感器的实用性，并能够简单快速、灵敏的检测ache和ops。本发明为复杂基质中分析物的双模式定量提供了一种有前景的策略，拓宽了纳米酶在即时检测中的应用。