一种近红外荧光硅点及其制备方法和在抗菌和肿瘤治疗中的应用

本发明属于化学纳米材料领域，具体涉及一种近红外荧光硅点及其制备方法和在荧光成像、伤口抗菌、肿瘤光动力治疗和化学动力学治疗中的应用。

背景技术：

1、近年来，纳米材料和纳米材料加工技术领域发展迅速，极大地促进了纳米生物技术的发展。尤其是纳米材料在生物成像和生物医学领域应用前景极具吸引力。其中，量子点由于其优异的光学性质包括高荧光、单激发、发射光谱可调以及抗光漂白等性质脱颖而出，可以作为荧光探针来成像或检测生物体内的分析物，为生物分析提供可靠的数据。传统的量子点通常指的是镉系半导体晶体，多数含有铅、镉等重金属元素，在对人体和环境造成一定伤害的同时也限制了量子点在生物和医学领域的发展。因此寻找其他具有优良生物相容性的新型量子点材料就显得尤为重要。

2、经研究发现，当硅材料缩小到纳米尺度时，其性能就会发生突变，会使其在多种方面产生优异新颖的性能，称这样的硅材料为硅量子点。它是一种零维半导体荧光纳米材料，除了优异的光学特性，硅量子点还有许多其他量子点不具备的优点，如优异的生物相容性、稳定的抗光致荧光漂白性、合成工艺简单以及发射光谱可调等。尤其是水溶性有机硅量子点，在电化学性能、光化学性能、生物相容性等方面都展现出了巨大的发展潜力。

3、此外，已报道的有机硅量子点也或多或少存在一些缺陷，如发射波长短，细胞毒性高，量子产率低，组织穿透能力弱，合成步骤繁琐复杂等。如果能克服这些问题，会使硅量子点在生物应用方面有更进一步的发展。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明以一步水热法制备了一种近红外荧光硅点，该硅点具有高的荧光量子产率，良好的荧光稳定性，无毒性，制备成本低，方法简易，并且此硅量子点可以用于生物体的荧光成像、伤口的抗菌、肿瘤的光动力(pdt)治疗和化学动力学(cdt)治疗。

2、本发明还提供所述近红外荧光硅点的制备方法和应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种近红外荧光硅点，所述近红外荧光硅点通过一步水热法由4-羧基卟吩染料(tcpp)的羧基与硅烷偶联试剂的氨基之间经高温缩合反应生成。

4、其中，所述近红外荧光硅点其直径在1-10nm范围内；主要含有c、n、o、si四种元素。

5、其中，所述近红外荧光硅点具有荧光性能，在650nm-700nm的近红外波段具有强的荧光发射峰。

6、其中，所述硅烷偶联试剂包括二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷(aeea)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(ameo)、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(aptms)、n-(beta-氨乙基)-gama-氨丙基三甲氧基硅烷(damo)中的任意一种或者多种。

7、本发明所述的近红外荧光有机硅量子点的制备方法，包括如下步骤：

8、(1)由荧光染料tcpp、硅烷偶联试剂、去离子水通过一步水热法进行反应；

9、(2)将步骤(1)中反应溶液离心透析后冷冻干燥获得的固体粉末为近红外荧光有机硅量子点。

10、其中，步骤(1)中tcpp与去离子水先按质量比1-3:400混合，再加入硅烷化试剂到上述混合液中，超声使其混合均匀，所述tcpp与硅烷偶联试剂的摩尔比为1：80-120。

11、其中，步骤(1)所述水热反应的反应温度140-200℃，时间为3-8小时。

12、作为优选，本发明所述的荧光有机硅量子点的制备方法，包括如下步骤：

13、将荧光染料tcpp固体溶于去离子水中，用移液枪加入硅烷偶联试剂aeea，经过水热反应，然后停止加热，冷却，取出反应溶液，透析除去未反应试剂，再离心保留上清液；

14、将步骤(1)中上清液冷冻干燥获得的固体粉末为近红外荧光有机硅量子点。

15、其中，步骤(1)中tcpp与适量去离子水混合，其质量比为3：400，再加入aeea；tcpp与aeea的优选摩尔比例为1：100。其中，步骤(1)所述水热反应的反应温度160℃，时间为4小时。

16、本发明述的近红外荧光硅点在制备生物体创口抗菌以及荧光成像试剂中的应用。

17、本发明所述的近红外荧光硅点在制备肿瘤治疗光动力制剂中的应用。

18、本发明所述的近红外荧光硅点在制备肿瘤治疗化学动力学制剂中的应用。

19、进一步地，所述近红外荧光硅点作为生物荧光探针或作为pdt/cdt联合治疗药物制剂应用于抗菌和抗肿瘤。

20、本发明利用tcpp水溶液与硅烷偶联试剂混合，在水热反应釜中进行高温反应，合成的荧光有机硅量子点具有极好的生物相容性、优异的近红外发光性能和卓越的光化学稳定性，可应用于生物医学领域。

21、本发明所述的一种近红外荧光硅点，由荧光探针tcpp水溶液与硅烷偶联试剂通过一步水热法合成。四种硅烷偶联试剂二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷(aeea)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(ameo)、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(aptms)、n-(beta-氨乙基)-gama-氨丙基三甲氧基硅烷(damo)在实验中效果基本一致，这里以aeea为代表，tcpp的羧基与aeea的氨基之间经高温缩合反应形成近红外发射荧光硅点。

22、本发明制备的是一种类球形的零维近红外荧光硅点，是由tcpp水溶液与硅烷偶联试剂aeea通过水热法一步合成得到。由于制备成本低廉，方法简易，且具备光化学稳定性好、生物相容性优、荧光量子产率高等优点，在生物医学方面展现了巨大的发展潜力。本发明的荧光硅量子点材料一方面具有良好的单线态氧产生性能，可作为pdt制剂，另一方面，具有过氧化物酶活性，可以催化氧化氢转化为有害的羟基自由基，可作为cdt制剂。因此，该近红外有机硅量子点可以作为pdt/cdt联合治疗试剂，用于生物伤口抗菌和肿瘤诊疗。在小鼠模型中该近红外荧光硅点通过pdt/cdt联合治疗取得了良好的疗效。

23、本发明首次提出一种应用于伤口抗菌和肿瘤治疗的零维近红外荧光硅点，其原材料选择简单，制备方法简单，无毒性，有利于生物医学应用，与之前繁琐复杂的两种主流合成方法“自上而下”合成法相比，使用的一步水热法却能够控制硅点的尺寸大小，使其形貌均一且高纯度，不需要昂贵的设备和苛刻的条件。此外，原料廉价，还可以快速量产。

24、本发明采用特定的原料和特定制备方法制备得到近红外荧光硅点，其中光疗卟啉类化合物具有产生高水平活性氧和低暗毒性的能力，这些特性使它们成为强大的光敏剂，但tcpp本身水溶性不好，发光不强，原料tcpp与硅烷试剂反应生成硅点之后，由于羧基和氨基的结合水溶性提高，产生更高pdt效果的同时，还能催化过氧化氢分解产生羟基自由基，能够用于化学动力学治疗。同时，纳米级的尺寸改善了生物分布，所制备的近红外荧光硅点具有光动力治疗(pdt)/化动力协同治疗能力，在硅量子点领域，这种生产工艺简单稳定的材料同时又具备荧光成像和协同治疗等多种效果使它具有特色。同时一般形成的量子点多由于良好的荧光特性(大多为蓝光、绿光或黄光)、水分散性以及硅纳米荧光光学调控用于荧光标记，本发明除了这些外，由于原料本身性质以及原料之间结合合成了近红外发光的硅点，且产生了特有的pdt/cdt协同治疗效果和抗菌效果，用于荧光成像的同时还能进行肿瘤治疗。

25、本发明中羧基的存在使得tcpp具有氢键作用和强烈的分子内反应活性。并且tcpp的热稳定性很高，羧基与硅烷偶联试剂的氨基之间能够通过高温缩合快速结合，生产更高效并提升产率。tcpp本身又是重要的光敏材料，光物理性质与卟啉类化合物相似，与硅烷试剂结合后具有更强的稳定性和更高的水溶性，受到光激发时能产生较强近红外荧光，并能产生更强的光敏剂作用。

26、本发明由于tcpp本身的热稳定性高、羧基导致的分子内反应活性强，使得与硅烷试剂合成反应时间比现有近红外硅点合成方法更短，通过一步水热法时间短至3h即可合成，更加高效，所制备的硅点稳定性高，水溶性好。另一方面，现有硅点大多只具备可见光发射性能，主要应用在生物传感及生物成像方面，而本发明所制备的近红外荧光硅点，不仅具有高的单线态氧产生能力，还能催化过氧化氢分解产生羟基自由基，可以同时实现光动力与化动力治疗，这是本发明重要的作用。

27、本发明中硅烷偶联剂本身不具有抗菌或者抗肿瘤的效果，tcpp本身可作为光敏材料，可以产生单线态氧，具有光动力治疗性能，但有机染料分子水溶性较差，光稳定性不好。本发明特定制备方法生成硅点后，水溶性和光稳定性，以及发光效率增强，单线态氧产率增大，光动力治疗效率提高，而且还能催化过氧化氢产生羟基自由基，发挥化动力治疗效率，光动力/化动力联合治疗在抗菌、抗肿瘤效果上显著增强。

28、本发明合成的硅点不仅具备pdt/cdt协同治疗效果，可以作为抗肿瘤纳米药物使用，同时比起一般作为荧光成像试剂的发蓝、黄、绿光的硅点而言，tcpp与硅烷偶联试剂相结合产生的该硅点具有近红外发光特性使其在生物成像领域也更具优势，近红外荧光能够更好的穿透生物组织，实现更高的成像分辨率和深度，并且由于纳米颗粒对肿瘤部位的被动靶向性能，作为生物成像探针更为优异。

29、本发明关键原料是4-羧基卟吩染料tcpp，关键步骤即为160℃下的一步水热法，使得tcpp的羧基与硅烷偶联试剂的氨基之间经高温缩合反应，这步高温高压下的羧基氨基缩合反应使得产物稳定性、水溶性增强，同时比tcpp原料本身的各方面性能更加优异。本发明中tcpp原料本身以及合成产物硅点的活性氧产率对比(图9)，本发硅点明的活性氧产率远大于tcpp本身的活性氧产生。tcpp原料本身以及合成产物硅点的不同ph值下的荧光稳定性对比(图10)，本发明硅点在2-12范围内ph值下表现出tcpp所不具备的光稳定性能。本发明硅点的lineweaver-burk(图11)得到vmax和km，分别为8.98125x10-5m/min和3.30245x10-3m，强于已知的辣根过氧化物酶，证明了si nds具有过氧化物酶性质，可以将h2o2高效催化转化为·oh，si nds可以作为高性能纳米酶实现化学动力学(cdt)治疗。tcpp原料本身以及合成产物硅点的激光前激光后的mtt细胞存活率对比试验(图12)，通过相同浓度下的存活率数值对比，证明本发明硅点在低毒性的前提下比起原料tcpp更高效的肿瘤细胞杀死效果。tcpp原料本身以及合成产物硅点的激光前激光后的细胞活死染色对比实验(图13)，通过pi/am染色图同样证明本发明硅点在同浓度的前提下比起原料tcpp更高效的pdt/cdt协同治疗肿瘤细胞杀死效果。tcpp原料本身以及合成产物硅点的细胞内ros检测，通过dcfh染色对比实验(图14)，同样证明比原料tcpp高的活性氧产生。tcpp原料本身以及合成产物硅点的激光前激光后的细菌活死染色对比实验(图15)，体外抗菌测试组的细菌存活率比较(图16)，s-aureus金黄色葡萄球菌感染的小鼠皮下伤口抗菌治疗效果组(图17)，均证明本发明硅点效果显著强于tcpp。

30、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

31、1、本发明直接利用tcpp水溶液和硅烷偶联试剂通过特定的一步水热法制备生成零维近红外荧光有机硅量子点，是由tcpp的羧基与aeea的氨基之间反应促进形成所得，由于tcpp本身具有一定荧光强度且合成的量子点荧光得到较明显提高，其荧光强度高，量子产率较高，且形貌较均一，荧光稳定性好，有利于生物医学应用，并且制备方法简单方便，具有良好的生物相容性和安全性，并且成本低。

32、2、本发明制备的荧光有机硅量子点展现出较强的近红外荧光和良好的水溶性，在650nm-700nm波长附近具有强的荧光发射峰，展现出良好的荧光光谱性能，因此硅量子点具有相对较好的细胞组织穿透性。由于其独特的光学性质和相对较好的细胞组织穿透性，可以有效进行活体荧光成像。

33、3、本发明制备的荧光有机硅量子点除了优异的近红外光学性能以及良好的生物相容性外，还具有优异的单线态氧产生性能以及过氧化物酶性能，可作为光动力/化动力协同治疗试剂，用于抗菌和抗肿瘤应用，且对生物体本身无毒副作用。