一种花粉结构微粒及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种分析检测技术领域的生物功能材料及其制造方法，特别涉及用来捕获循环肿瘤细胞的生物功能材料及其制造方法和用途。具体地，本发明涉及一种用于捕获循环肿瘤细胞的花粉结构微粒及其制备方法和用途。

背景技术：

癌症是目前威胁人类健康最严重的疾病之一，而肿瘤的侵袭和转移是癌症患者临床致死的主要原因。循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，ctcs)是在肿瘤的形成或生长过程中从原位肿瘤病灶脱离进入人体外周血循环系统的细胞。ctcs可以被转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终形成新的转移灶。因此，监测血液中ctcs的数量及类型变化，对于患者预后判断、疗效评价都有着重要的指导作用。对血液中ctcs的检测分析，也被称为“液体活检”技术，被认为最具潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段之一，对实现癌症的个体化治疗具有重要意义。

由于ctcs在外周血中含量极低，因此对于ctcs检测技术的灵敏度和特异度都有很高的要求。针对肿瘤细胞与血液中正常细胞尺寸、密度等物理性质区别，和针对抗原抗体识别的生化性质区别，目前ctcs主要的分离方法有过滤法、电泳法、磁性纳米颗粒、微流控芯片法。文献small2015，11，3850，angew.chem.int.ed.2016，55，1252，chem.soc.rev.，2017，46，4245综述了近年来ctcs捕获的方法和技术。虽然这些方法都具有一定的ctcs捕获效果，但也存着各种不足，如材料制备过程较为复杂，有的捕获率不高或富集时间较长等。

研究表明，微纳米结构材料具有复杂多样的多级结构，通过其与细胞表面纳米结构(eg.微绒毛、伪足等)的三维相互作用，可以显著影响着细胞的粘附、生长、分化及蛋白表达等生命活动。近年来，许多种类的纳米结构(eg.纳米粒子、纳米线、纳米纤维等)，被用于ctcs捕获分离。这些纳米材料虽然可以通过增大比表面积增加与ctcs的接触机会，但要想进一步提高ctcs的捕获率，仍然需要上皮细胞粘附分子(epithelialcelladhesionmolecule，epcam)抗体或核酸适配体为识别分子的加入。如文献nanolett.16，1，766-772中，feilongzhang等人使用铟锡氧化物纳米线捕获ctcs，在不加入epcam抗体的情况下，捕获率仅有40％，加入epcam抗体后，捕获率才能进一步提高至89％。但是，由于ctcs会发生上皮细胞间质转变，且不是每种肿瘤细胞都表达上皮标志，因此使用单一的epcam抗体捕获ctcs往往会造成假阴性结果。另外抗体的生产价格昂贵，采用多种特异性标志物抗体联合使用又会导致成本的增加；而核酸适配体的稳定性不足，易被核酸酶降解。中国专利cn201410326400.1，cn201510252919.4，cn201510677697.0，cn201710014061.7中也分别公开了捕获ctcs的方法或技术，但也存在上述类似的缺陷。

花粉是一种天然的微米粒子，来源广泛，价格低廉。花粉具有多级微纳结构，有利于与ctcs的伪足相互作用，在不需要修饰特异性识别分子的情况下即可达到近90％以上的ctcs捕获率。目前尚未有报道利用花粉微粒用于捕获循环肿瘤细胞的方法。

技术实现要素：

本发明是基于解决现有的技术问题而完成的，其目的在于，提供一种用于捕获循环肿瘤细胞的花粉结构微粒及其制备方法和用途。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明第一方面：

1、一种花粉结构微粒，所述花粉结构微粒具有芯部和表层，所述表层具有下表层以及上表层，所述下表层与所述上表层通过支撑柱连接，其中，

所述上表层具有若干孔，其孔间距范围为50～500nm，其孔径范围为50～1000nm，所述上表层的孔隙率范围为15％～80％，

所述支撑柱的高度范围为200nm～5000nm。

2、根据上述1所述的花粉结构微粒，所述支撑柱的直径范围为50～500nm。

3、根据上述1或2所述的花粉结构微粒，所述花粉结构微粒为源自莲科、金粟兰科、八角科、菊科、十字花科、五味子科、山茶科中的一种或多种植物的花粉微粒。

4、根据上述1～3所述的花粉结构微粒，所述花粉微粒为菊花花粉微粒和/或油菜花花粉微粒。

本发明第二方面：

5、一种上述1～4所述的花粉结构微粒的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)将花粉微粒加入到脱脂剂中，充分搅拌进行脱脂，得到脱脂花粉微粒；

(2)将所述脱脂花粉微粒加入到碱性溶液中，搅拌，然后对所得花粉微粒清洗，烘干，得到碱洗花粉微粒；

(3)将所述碱洗花粉微粒加入到酸中进行酸洗，将酸洗后的所述花粉微粒用去离子水清洗，再用乙醇清洗，烘干。

6、根据上述5所述的制备方法，所述脱脂剂选自甲醇或丙酮。

7、根据上述5或6所述的制备方法，所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

8、根据上述5～7所述的制备方法，所述酸选自浓盐酸、浓硫酸、浓硝酸中的一种。

9、根据上述8所述的制备方法，其特征在于，所述酸为浓硫酸。

本发明第三方面：

10、一种上述1～4所述的花粉结构微粒在捕获循环肿瘤细胞中的用途。

有益的效果

本发明的花粉结构微粒能够快速有效地捕获循环肿瘤细胞。本发明所提供的捕获循环肿瘤细胞技术无需修饰特异性癌细胞识别抗体或核酸适配体，可实现不同癌细胞类型的捕捉，具有成本低廉、操作简便的优势。所制备的花粉结构微粒表面可用于捕获外周血中的循环肿瘤细胞，有望用于癌症患者的早期诊断、检测、分析，癌细胞的去除以及血液净化。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的菊花花粉结构微粒的扫描电镜照片，比例尺为5μm。

图2是本发明实施例1制备的菊花花粉结构微粒的表层侧剖面的扫描电镜照片，比例尺为100nm。

图3是本发明实施例1中在对菊花花粉处理之前与处理之后的对比图，比例尺均为5μm。

图4是本发明实施例1中得到的菊花花粉结构微粒在捕获mcf-7癌细胞后的扫描电镜照片，比例尺为5μm。

图5是本发明对比例1中得到的、经处理后的菊花花粉微粒的扫描电镜照片，比例尺为2μm。

附图标记说明：

1：上表层；2：下表层；3：支撑柱；4：孔；5：癌细胞；6：伪足

具体实施方式

为了使本发明更容易理解，所使用的术语用以下来定义。提及的术语和短语如有和公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

如本发明所述，术语“花粉结构微粒”是指具有花粉结构的微粒。

本发明的花粉结构微粒具有芯部和表层，该表层具有下表层以及上表层(最外层)，该下表层与该上表层通过支撑柱连接。

前述上表层具有若干个孔，该孔可以贯通上表层，也可以不贯通上表层。可以所有孔均为贯通上表层的孔，也可以是一部分为贯通上表层的孔、一部分为不贯通上表层的孔。只要是该孔有助于能够起到捕获、富集的作用，则不限于是否贯通。优选为所有孔均为贯通上表层的孔。

前述孔间距范围为50～500nm，优选为70～450nm，更优选为100～400nm。通过使孔间距范围控制在上述范围，可以更有效地发挥纳米结构的三维作用，增强细胞的粘附和捕获。

前述上表层的孔径范围为50～1000nm，优选为60～550nm，更优选为100～450nm。

前述上表层的孔隙率范围为15％～80％，优选为20％～75％，更优选为35％～69％。该孔隙率大于80％，则微粒表面的孔过大，无法成型，不利于负载；若该孔隙率小于15％，则不利于例如肿瘤细胞伪足较多伸入至孔中，不利于实现本发明的捕获效果。

前述支撑柱将花粉结构微粒的下表层与上表层连接，客观上起到了支撑整个花粉结构微粒的骨架的作用。该支撑柱的高度范围为200nm～5000nm，优选为200nm～3000nm，进一步优选为200nm～800nm。该支撑柱的直径范围为50～500nm，优选为100nm～400nm。

前述花粉结构微粒为源自莲科、金粟兰科、八角科、菊科、十字花科、五味子科、山茶科中的一种或多种植物的花粉微粒，只要是能够获得本发明的花粉结构微粒，则不限于上述种类，优选选自菊花花粉微粒和/或油菜花花粉微粒。

本发明的花粉结构微粒的制备方法包括以下步骤：

(1)将花粉微粒加入到脱脂剂中，充分搅拌进行脱脂，得到脱脂花粉微粒；

(2)将所述脱脂花粉微粒加入到碱性溶液中，搅拌，然后对所得花粉微粒清洗，烘干，得到碱洗花粉微粒；

(3)将所述碱洗花粉微粒加入到酸中进行酸洗，将酸洗后的所述花粉微粒用去离子水清洗，再用乙醇清洗，烘干。

进一步，在上述步骤(1)，前述脱脂剂选自丙酮、甲醇、乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷和二氯乙烷中的一种或多种。

进一步，在上述步骤(1)中，脱脂时间根据花粉的种类来适当选择，只要是能够将花粉表面的脂类物质充分去除即可，优选为6～24小时。

进一步，在上述步骤(1)中，可以边搅拌边进行脱脂。搅拌可以使用本领域通常的方法，所使用的搅拌方式可以是机械搅拌或磁力搅拌。对于搅拌时间，优选在常温条件下搅拌6～24小时，更优选搅拌时间为12～24小时。可选地，在搅拌过程中，采用相应的搅拌速率进行搅拌，搅拌速率并非固定不变，例如，搅拌速率根据花粉微粒脱脂剂中的分布状态进行适当调整，可以是300～2000rpm/min，优选为1000～2000rpm/min。

进一步，在上述步骤(2)中，前述碱性溶液可以选自氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠中的一种。优选为氢氧化钠。碱性溶液的浓度为4～10％(w/v)，优选为4～8％(w/v)。

进一步，在上述步骤(2)中，可以边搅拌边进行碱洗。搅拌可以使用本领域通常的方法，所使用的搅拌方式可以是机械搅拌或磁力搅拌。对于搅拌时间，优选在常温条件下搅拌6～24小时，更优选搅拌时间为12～24小时。可选地，在搅拌过程中，采用相应的搅拌速率进行搅拌，搅拌速率并非固定不变，例如，搅拌速率根据脱脂花粉微粒在碱性溶液中的分布状态进行适当调整，可以是300～2000rpm/min，优选为1000～2000rpm/min。

进一步，在上述步骤(2)中，通过将所得碱洗后的花粉微粒用例如去离子水进行清洗。进行清洗的次数为1～5遍，优选为3～5遍。

进一步，在上述步骤(2)中，在对花粉微粒进行清洗之后进行烘干，烘干可以使用外部加热系统或内部加热系统，但并没有没有具体限制，例如烘干可以是常压烘干，也可以是减压烘干，优选抽真空烘干。另外，烘干可以使用固定电炉、流化电炉、旋转电炉、燃烧炉或微波系统进行。

进一步，在上述步骤(3)中，酸洗所使用的酸可以选自浓盐酸、浓硫酸、浓硝酸等，其中，优选浓硫酸使用。在使用浓硫酸进行酸洗时，浓硫酸的浓度为75～99％(v/v)，低于75％，则无法对结构表面进行蚀刻和碳化，从而无法实现本发明的效果。

进一步，在上述步骤(3)中，搅拌可以与上述步骤中的搅拌方式相同。对于搅拌时间，优选在常温条件下搅拌24～72小时，更优选搅拌时间为48～72小时。

进一步，在上述步骤(3)中，通过将所得酸洗后的花粉微粒用例如去离子水进行清洗，并进行烘干，从而得到碱洗花粉微粒。进行清洗的次数为1～5遍，优选为3～5遍。

进一步，在上述步骤(3)中，优选在用例如去离子水进行清洗后、在烘干之前，用醇溶液对花粉微粒进行二次清洗，该醇溶液没有特别限定，优选乙醇。进行清洗的次数为1～3遍，优选为3遍。

进一步，在上述步骤(3)中，烘干可以使用外部加热系统或内部加热系统，但并没有没有具体限制，例如烘干可以是常压烘干，也可以是减压烘干，优选抽真空烘干。另外，烘干可以使用固定电炉、流化电炉、旋转电炉、燃烧炉或微波系统进行。

在通过上述步骤得到花粉结构微粒之后，还可选择性地将该花粉结构微粒固载在载体上。

经过上述制造方法得到的本发明的花粉结构微粒，对循环肿瘤细胞例如人乳腺癌细胞(mcf-7细胞)，人表皮癌细胞(a431细胞)，人宫颈癌细胞(hela细胞)和人非小细胞肺癌细胞(a549细胞)的捕获率高达85％以上，优选为90％以上。

通过上述步骤(1)～步骤(3)，所得花粉结构微粒表面具有若干特殊分布的孔，表面形成多级微纳结构，从而可以高效捕获诸如ctcs等。本发明的采用价格低廉、来源广泛的天然花粉微粒，无需固载特异性癌细胞识别抗体或核酸适配体，能有效的降低使用成本。该种结构的花粉结构微粒，可实现对不同癌细胞类型的捕捉，具有较好的广谱性，可应用于癌症患者的早期诊断。

以下，举出实施例来说明本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式不受如下这些实施例的限制，可在不影响本发明所要达到的技术效果的范围内做出任意选择和变更。实施例和试验例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例选用的花粉微粒为天然菊花花粉(平均粒径为22μm)，以购买于中科院细胞库的人乳腺癌细胞(mcf-7细胞)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证，包括以下步骤：

1.制备用于捕获循环肿瘤细胞的菊花花粉结构微粒

将50g的天然菊花花粉粒子加入到1l丙酮中，在常温的条件下，以1000转/分钟的速率，搅拌6小时，过滤后得到脱脂菊花花粉微粒。

将脱脂菊花花粉微粒加入到浓度为4％(w/v)，体积为1l的naoh碱性溶液中，在常温的条件下，以1000转/分钟的速率，搅拌12小时。将碱洗后的菊花花粉微粒过滤，用去离子水清洗3遍，去除残余的碱性溶液，然后常温条件下将菊花花粉微粒真空烘干。

将烘干后的碱洗菊花花粉加入到浓度为98％(v/v)的浓硫酸中，在常温的条件下，以1000转/分钟的速率，搅拌24小时。将酸洗后的菊花花粉微粒用去离子水清洗3遍，去除残余的硫酸，再用乙醇清洗3遍，常温条件下将菊花花粉微粒真空烘干，得到处理后的菊花花粉结构微粒。

用喷涂法将所得菊花花粉结构微粒固载在长为1cm、宽为1cm的硅片上，留待备用。

在显微镜下观察所得菊花花粉结构微粒的结构，其中，图1示出了实施例1得到的菊花花粉结构微粒的扫描电镜照片(比例尺为5μm)，图1中清晰地示出在该微粒上表层(表面)分布有若干孔；图2示出了实施例1得到的菊花花粉结构微粒的表层侧剖面的扫描电镜照片(比例尺为100nm)，从图2可知，在微粒表层具有下表层以及上表层，其下表层与上表层之间通过若干支撑柱连接；图3示出了实施例1中在对菊花花粉处理之前(a)与处理之后(b)的对比图(比例尺均为5μm)，从图3可知，在处理之前尽管在表面存在一定数量的孔，但孔的数量少，分布不均匀，而在经过本发明的工序处理之后，孔的数量和密度大大增加，且分布相对均匀。

接着，选取少量上述菊花花粉结构微粒，将该样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照(共计100张)，随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到该微粒的参数如下：

微粒直径：22μm

上表层的孔径范围：65～453nm平均值：135nm

上表层的孔间距范围：70～270nm平均值：160nm

支撑柱直径范围：100～220nm平均值：180nm

支撑柱高度范围：430～720nm平均值：540nm

通过image-j软件计算该菊花花粉结构微粒的孔隙率为56％。

其中，上述孔隙率的计算方式如下：

孔隙率＝(x/n)×100％(式1)

x：孔面积n：视野面积

通过上式1计算每一个视野的孔隙率，然后取所有视野的孔隙率的平均值，即得到花粉结构微粒的孔隙率。

2.准备待测的循环肿瘤细胞样品：

取mcf-7细胞悬浮液100μl，用细胞计数器计数并计算其浓度。吸取一定量的上述细胞悬浮液，用dmem细胞培养基稀释至1×10⁵个细胞/ml。

3.捕获实验：

将上述步骤1中固载有菊花花粉结构微粒的硅片放入细胞培养板中，然后将上述步骤2混合均匀的细胞悬浮液1ml滴加到菊花花粉结构微粒表面，然后置于细胞培养箱中，捕获时间为60分钟。

作为对照实验组1，对固载有天然菊花花粉粒子的硅片表面也进行相同的待测样品中的捕获循环肿瘤细胞实验。

捕获时间结束后，将捕获有循环肿瘤细胞的菊花花粉微粒表面用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗三次，用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液固定捕获的癌细胞30分钟，将捕获的癌细胞浸泡在浓度为10μg/ml的dapi水溶液中30分钟，达到染色的目的。最后在olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(共计100张)，随机选取20张不同视野下的荧光照片，利用imagej软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获率。对照实验组1也按照上述步骤进行，并计算捕获率。

捕获率的计算方法如下：

将步骤1中固载有菊花花粉微粒的硅片放入细胞培养板中(底面积为2cm²)。

捕获率＝[(x/ax)/(n/a)]×100％(式2)

x：10倍荧光显微镜下所照得的荧光照片中循环肿瘤细胞的捕获数量；

ax：10倍荧光显微镜下所照得的荧光照片视野大小；

x/ax：实际捕获的细胞密度；

n：细胞的总投放量(本实施例中为“10⁵个细胞/毫升”)；

a：细胞培养版底面积(本实施例中为“2cm²”)

n/a：投放细胞的密度

通过上式2计算每一个视野的捕获率，然后取所有视野的捕获率的平均值，即得到花粉结构微粒对循环肿瘤细胞的捕获率。

上述实验结果表明，mcf-7癌细胞在固载有菊花花粉结构微粒的硅片表面伸出较多伪足，铺展状态良好(参见图4)，菊花花粉微粒表面对mcf-7癌细胞的捕获率达到92％，而对照实验组1中，固载有天然菊花花粉粒子的硅片对mcf-7癌细胞的捕获率仅为7％，表明该微粒可以实现循环肿瘤细胞的高效捕获。

实施例2

本实施例选用的花粉微粒为天然油菜花粉(平均粒径为20μm)，以购买于中科院细胞库的人乳腺癌细胞(mcf-7细胞)，人表皮癌细胞(a431细胞)，人宫颈癌细胞(hela细胞)和人非小细胞肺癌细胞(a549细胞)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证，包括以下步骤：

1.制备用于捕获循环肿瘤细胞的油菜花粉结构微粒

将75g的天然油菜花粉粒子加入到1l甲醇中，在常温的条件下，以1000转/分钟的速率，搅拌12小时，过滤后得到脱脂油菜花粉微粒。

将脱脂油菜花粉微粒加入到浓度为6％(w/v)，体积为1l的naoh碱性溶液中，在常温的条件下，以1000转/分钟的速率，搅拌18小时。将碱洗后的油菜花粉微粒过滤，用去离子水清洗4遍，去除残余的碱性溶液，然后常温条件下将油菜花粉微粒真空烘干。

将烘干后的碱洗油菜花粉微粒加入到浓度为70％(v/v)的浓硫酸中。在常温的条件下，以1000转/分钟的速率，搅拌48小时。将酸洗后的油菜花粉微粒用去离子水清洗3遍，去除残余的硫酸，再用乙醇清洗3遍，常温条件下将油菜花粉微粒真空烘干，得到处理后的油菜花粉结构微粒。

用喷涂法将所得油菜花粉结构微粒固载在长为1cm、宽为1cm的硅片上，留待备用。

此外，选取少量上述油菜花粉结构微粒，将该样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照(共计100张)，随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到该微粒的参数如下：

微粒直径：24μm

上表层的孔径范围：240～520nm平均值：290nm

上表层的孔间距范围：250～400nm平均值：330nm

支撑柱直径范围：240～440nm平均值：330nm

支撑柱高度范围：250～870nm平均值：520nm

通过与实施例1相同的方法测得该油菜花粉结构微粒的上表层的孔隙率为68％。

2.准备待测的循环肿瘤细胞样品：

分别取人mcf-7、a431、hela和a549细胞悬浮液各100μl，用细胞计数器计数并计算其各自浓度；分别吸取一定量的上述细胞悬浮液，用dmem细胞培养基稀释各自悬浮液至1×10⁵个细胞/ml。

3.捕获实验：

将上述步骤1中固载有油菜花粉结构微粒的硅片放入细胞培养板中，然后将双数步骤2混合均匀的细胞悬浮液1ml滴加到油菜花粉结构微粒表面，然后置于细胞培养箱中，捕获时间为60分钟；作为对照实验组2，对固载有天然油菜花粉粒子的硅片表面，分别针对人mcf-7、a431、hela和a549细胞也进行相同的4组捕获循环肿瘤细胞实验。

捕获时间结束后，将捕获有循环肿瘤细胞的油菜花粉微粒表面表面用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗三次，用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液固定捕获的癌细胞30分钟，将捕获的癌细胞浸泡在浓度为10μg/ml的dapi水溶液中30分钟，达到染色的目的。最后在olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(共计100张)，随机选取20张不同视野下的荧光照片，利用imagej软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获率，捕获率的计算方法同实施例1。对照实验组2也按照上述步骤进行，并计算捕获率。

实验结果表明，制备的油菜花粉微粒表面对mcf-7、a431、hela和a549癌细胞的捕获率分别达到89％、92％、87％和90％，表明该微粒可以实现对不同癌细胞系的高效捕获，具有较好的广谱性。

实施例3

本实施例选用的花粉微粒为天然菊花花粉(平均粒径为22μm)，向外周血单核细胞中加入购买于中科院细胞库的人乳腺癌细胞(mcf-7细胞)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证，包括以下步骤：

1.制备用于捕获循环肿瘤细胞的菊花花粉微粒

将100g的天然菊花花粉粒子加入到1l丙酮中。在常温的条件下，以1000转/分钟的速率，搅拌24小时，过滤后得到脱脂花粉。

将脱脂花粉加入到浓度为10％(w/v)，体积为1l的naoh碱性溶液中。在常温的条件下，以1000转/分钟的速率，搅拌12小时，将碱洗后的花粉过滤，用去离子水清洗5遍，去除残余的碱性溶液，然后常温条件下将花粉真空烘干。

将烘干后的碱洗菊花花粉微粒加入到浓度为70％(v/v)的浓硫酸中，在常温的条件下，以1000转/分钟的速率，搅拌72小时。将酸洗后的花粉用去离子水清洗3遍，去除残余的硫酸，再用乙醇清洗3遍，常温条件下将花粉真空烘干，得到处理后的菊花花粉结构微粒。

用喷涂法将所得菊花花粉结构微粒固载在长为1cm、宽为1cm的硅片上，留待备用。

接着，选取少量上述菊花花粉结构微粒，将该样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照(共计100张)，随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到该微粒的参数如下：

微粒直径：22μm

上表层的孔径范围：55～436nm平均值：118nm

上表层的孔间距范围：75～290nm平均值：190nm

支撑柱直径范围：110～235nm平均值：189am

支撑柱高度范围：425～718nm平均值：545nm

通过与实施例1相同的方法测得该油菜花粉结构微粒的上表层的孔隙率为49％。

2.准备待测的循环肿瘤细胞样品：

取5ml新鲜抗凝血，向血液中加入外周血单核细胞分离液(北京索莱宝生物科技，p8610)，利用密度梯度离心法分离外周血单核细胞，得到外周血单核细胞悬浮液，细胞浓度为0.8×10⁶个细胞/ml；取mcf-7细胞悬浮液100μl，用细胞计数器计数并计算其浓度；向外周血单核细胞悬浮液中分别加入癌细胞数量(单位：个细胞/ml)为130、168、214、241、399、534、691、786、812和1052的mcf-7细胞，混合均匀。

3.捕获实验：

将上述步骤1中固载有菊花花粉结构微粒的硅片放入细胞培养板中，然后将步骤2混合均匀的细胞悬浮液1ml滴加到菊花花粉结构微粒表面，然后置于细胞培养箱中，捕获时间为60分钟。

捕获时间结束后，将捕获了循环肿瘤细胞的菊花花粉微粒表面用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗三次，用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液固定捕获的癌细胞30分钟，将捕获的癌细胞浸泡在浓度为10μg/ml的dapi水溶液中30分钟，10μg/ml的cytokeratin-fitc磷酸盐缓冲液中60分钟，达到染色的目的。最后在激光共聚焦荧光显微镜10倍下分别拍照(共计100张)，随机选取20张不同视野下的荧光照片，利用imagej软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获率，捕获率的计算方法同实施例1。

实验结果表明，制备的菊花花粉微粒表面对外周血样本中，mcf-7癌细胞癌细胞数量(单位：个细胞/ml)分别为130、168、214、241、399、534、691、786、812和1052时，mcf-7细胞的捕获率分别如下述表1所示：

表1

从上述表1可知，不同mcf-7癌细胞癌细胞数量情况下的捕获率几乎达到90％以上，这表明该花粉结构微粒在不同投放量的循环肿瘤细胞的情况下，均可以实现从外周血中高效地捕获。

实施例4

本实施例选用的花粉微粒为蒲公英花粉(平均粒径为12μm)，除此以外，在与实施例1相同的条件下进行操作，得到蒲公英花粉结构微粒。

接着，与实施例1的步骤2和步骤3同样操作，在同样条件下进行捕获实验，结果，得到对比例3的花粉微粒的捕获率：89％。

接着，选取少量上述菊花花粉结构微粒，将该样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照(共计100张)，随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到该微粒的参数如下：

微粒直径：22μm

上表层的孔径范围：62～224nm平均值：142nm

上表层的孔间距范围：87～180nm平均值：126nm

支撑柱直径范围：76～175nm平均值：139nm

支撑柱高度范围：223～307nm平均值：255nm

通过与实施例1相同的方法测得该油菜花粉结构微粒的上表层的孔隙率为47％。

以上结果表明该微粒可以实现循环肿瘤细胞的高效捕获。

对比例1

将50g的天然菊花花粉粒子加入到1l丙酮中，在常温的条件下，以1000转/分钟的速率，搅拌6小时，过滤后得到脱脂菊花花粉微粒。在70℃下对该微粒烘干12小时，然后在300℃下在马弗炉中空气环境下加热6小时(升温速率10℃/分钟)，接着，将加热后的微粒在700℃管式炉中加热2小时，然后在氩气气氛中(流速250毫升/分钟)以升温速率10℃/分钟升温，得到处理后的菊花花粉微粒。然后将所得菊花花粉微粒固载在长为1cm、宽为1cm的硅片上，留待备用。

在显微镜下观察所得菊花花粉微粒的结构，参见图5。从该图5可知，该处理后的菊花花粉微粒体积明显收缩，上表面几乎观察不到孔。

接着，与实施例1的步骤2和步骤3同样操作，在同样条件下进行捕获实验，结果，得到对比例1的花粉微粒的捕获率为33.2％。

对比例2

除了在步骤1中不使用浓硫酸进行处理(不进行酸洗)以外，其它条件和步骤1与实施例1均相同，得到菊花花粉结构微粒。

接着，与实施例1的步骤2和步骤3同样操作，在同样条件下进行捕获实验，结果，得到对比例2的花粉微粒的捕获率为63％。

接着，选取少量上述菊花花粉结构微粒，将该样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照(共计100张)，随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到该微粒的参数如下：

微粒直径：22.5μm

上表层的孔径范围：37～398nm平均值：98nm

上表层的孔间距范围：82～370nm平均值：235nm

支撑柱直径范围：112～245nm平均值：197nm

支撑柱高度范围：415～738nm平均值：532nm

通过与实施例1相同的方法测得该油菜花粉结构微粒的上表层的孔隙率为32％。

对比例3

除了在步骤1中使用浓磷酸对烘干后的碱洗菊花花粉进行处理，而不使用浓硫酸进行处理，除此以外，其它条件和步骤与实施例1均相同，得到菊花花粉结构微粒。

接着，与实施例1的步骤2和步骤3同样操作，在同样条件下进行捕获实验，结果，得到对比例3的花粉微粒的捕获率：65％。

接着，选取少量上述菊花花粉结构微粒，将该样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照(共计100张)，随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到该微粒的参数如下：

微粒直径：22μm

上表层的孔径范围：52～431nm平均值：110nm

上表层的孔间距范围：89～301nm平均值：210nm

支撑柱直径范围：118～243nm平均值：195nm

支撑柱高度范围：421～725nm平均值：543nm

通过与实施例1相同的方法测得该油菜花粉结构微粒的上表层的孔隙率为39％。

产业上的可利用性

本发明涉及一种分析检测技术领域的生物功能材料及其制造方法，特别涉及用来捕获循环肿瘤细胞的生物功能材料及其制造方法。所制备的花粉结构微粒表面可用于捕获外周血中的循环肿瘤细胞，有望用于癌症患者的早期诊断、检测、分析，癌细胞的去除以及血液净化。