用于增强荧光生物测定的超亮荧光纳米复合材料结构的制作方法

用于增强荧光生物测定的超亮荧光纳米复合材料结构1.相关申请的交叉应用2.本技术要求2020年1月31提出申请的美国专利申请序列第62/968,314号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。技术领域3.本公开涉及用于增强荧光生物测定的超亮荧光纳米复合材料结构。背景技术：4.生物流体和组织中各种生物分子的检测和量化在生物医学研究和临床诊断中至关重要，因为如果不能准确和定量地询问组分分子，就不可能完全表征复杂的非线性生化系统。这个问题在生物医学研究的所有领域都无处不在，并且是充分了解健康、老龄化和疾病的主要障碍。这个问题并非微不足道，特别是对于没有扩增方案(如核酸的pcr)的蛋白质和肽而言，因为与疾病(如癌症、心脏病和神经变性)相关的分子的浓度可在从fg/ml水平到mg/ml的许多数量级的范围内。甚至同一分子的丰度也可能根据生理状态(例如，健康与疾病)或样品环境(例如，血液与脑脊液)而变化几个数量级。最后，对研究团体来说特别重要的是，样品极其珍贵，并且有时可用的数量也极其有限。荧光探针和荧光测定法已用于生物医学研究，不仅作为用以将细胞和各种亚细胞物种的位置和动力学以及细胞与组织中的分子相互作用可视化的成像工具，还作为荧光免疫测定中的标记/报告物，用于分子生物标志物的检测和量化。基于荧光的技术通过揭示疾病发生、发展和对疗法有反应的基因组、转录组和蛋白质组特征，从根本上改变了生物学和生命科学。然而，“微弱信号”一直是依赖荧光的一系列检测和成像技术中持续存在且反复出现的问题。所有基于荧光的生物分析技术的检测灵敏度最终受限于在询问期内可以从用作报告物的单个荧光物种收集的光量。通常，来自单个报告物荧光团的弱荧光信号和相关的差信噪比会限制当前基于荧光的测定的最终灵敏度。5.解决这一问题的一种方法是通过使用更灵敏的检测器和更高数值孔径的光学系统来改进检测仪器。这种方法的缺点是：1)检测仪器和光学系统花费巨大；以及2)较高的数值孔径导致明显受限的视野，使得测定读出非常长。此外，生物测定中使用的典型荧光团只有有限的可用寿命，在此期间，它们可以在光漂白之前发射光子。6.虽然荧光提供了优于诸如比色elisa或化学发光等测定检测方案的许多优点(包括多路复用、高动态范围、广泛的平台适用性(即可用于细胞中、细胞上、组织上、平板上、珠子上、溶液上等)，但荧光从根本上受到差信号的限制。在基于平板的测定中，采用了复杂的方案，如poly-hrp、pcr-elisa、亲和素-生物素-复合物(abc)elisa和酪胺信号扩增(tsa)，以实现改善的荧光检测灵敏度。所有这些方法都更复杂、更昂贵，并且通常比它们所替代的测定版本的动态范围更差。对于非常高的检测灵敏度，诸如数字elisa(quanterix simoa system)或电化学发光(meso scale discovery)等复杂技术都需要专门化的底物、设备和工作流程。7.在用光谱不同的荧光探针标记不同物种的光谱多路复用荧光测定中，可用的独特荧光团越多，测定多路复用的程度更高。特别地，激发光谱与发射光谱具有独特的组合。技术实现要素：8.在一个方面，本文公开了一种荧光纳米构建体结构，其包括具有至少一个局部表面等离子体共振波长(λlspr)的等离子体纳米结构、至少一个间隔涂层、至少一种具有最大激发波长(λex)的荧光剂和至少一个负载有肽的主要组织相容性复合体(mhc)分子(pmhc)。荧光纳米复合材料结构的荧光强度比单独的该至少一种荧光剂的荧光强度大至少500倍。9.在一些方面，纳米结构可以包括具有至少一个大于350nm的局部表面等离子体共振波长(λlspr)的涂银金纳米棒(aunr@ag)等离子体纳米结构、至少一个间隔涂层、至少一种具有最大激发波长(λex)的荧光剂和至少一种生物识别元件。在用银涂覆之前，用于形成aunr@ag的金纳米棒(aunr)具有至少一个大于650nm的局部表面等离子体共振波长。荧光纳米构建体的荧光强度比在类似的照明和检测条件下单独的至少一种荧光剂的荧光强度大至少500倍。10.在一个方面，本文公开了一种用于制作荧光纳米构建体的方法。该方法通常包括提供aunr@ag等离子体纳米结构，其中用于形成aunr@ag的金纳米棒(aunr)具有至少一个大于650nm的局部表面等离子体共振波长；用至少一个间隔涂层涂覆aunr@ag等离子体纳米结构，使至少一种荧光剂缀合到间隔涂层；用功能层涂覆间隔层；以及将生物识别元件缀合到该至少一个间隔涂层或功能层中的一者。11.在一方面，本文进一步公开了一种荧光纳米复合材料结构，其包括具有至少一个局部表面等离子体共振波长(λlspr)的等离子体纳米结构、至少一个间隔涂层、至少一种具有第一最大激发波长(λex1)和第一最大发射波长(λem1)的荧光剂、以及至少一种具有第二最大激发波长(λex2)和第二最大发射波长(λem2)的荧光剂。该荧光纳米复合材料结构可被λex1的光激发，并在λem2处发光，且λem2处的发光强度大于λem1处的发光强度。12.在一个方面，本文公开了一种具有长斯托克斯位移的荧光纳米构建体。纳米构建体通常包括具有至少一个局部表面等离子体共振波长(λlspr)的等离子体纳米结构、至少一个间隔涂层以及至少一种用作共振能量转移(fret)供体且具有最大激发波长(λex_d)的荧光剂和至少一种用作fret受体且具有最大发射波长(λem_a)的荧光剂；其中用作fret供体的荧光剂具有50nm内的λex_d和等离子体纳米结构的λlspr中的至少一个；并且其中荧光纳米构建体可以在λex_d处被激发并且发射λem_a的光。13.在一个方面，本文公开了一种用多个肽-mhc(pmhc)分子官能化并且能够识别对结合到mhc的肽具有特异性的t细胞抗原受体(tcr)的荧光纳米构建体。与结合到荧光标记的链霉亲和素的当前标准荧光试剂pmhc相比，用pmhc官能化的荧光构建体允许显著更高的检测灵敏度。这是由于本文公开的荧光纳米构建体允许每个复合体缀合多于四个mhc分子的事实，与荧光链霉亲和素不同，并且比用光谱等效的荧光团标记的链霉亲和素显著更亮。本文公开的pmhc修饰的荧光纳米构建体可以附着于多个tcr，然而它们以低细胞表面密度存在。14.在另一方面，本文公开了一种鉴定具有特异性t细胞受体的t细胞的方法。该方法可包括提供含有t细胞的样品，使含有t细胞的样品与荧光纳米复合材料结构接触，该荧光纳米复合材料结构包含至少一个负载有肽的主要组织相容性复合体(mhc)分子(pmhc)，该肽可特异性结合到含有对该肽具有特异性的受体的t细胞，在空间上分离t细胞，用将诱发荧光发射的光波长激发荧光纳米复合材料结构，以及检测用荧光纳米复合材料结构标记的t细胞。15.在下面的描述中部分地阐述了附加的实施例和特征，并且这些附加的实施例和特征对于本领域的技术人员来说在研究说明书后将变得显而易见，或者可以通过实践所公开的主题来学习。通过参考形成本公开一部分的说明书和附图的剩余部分，可以实现对本公开的性质和优点的进一步理解。附图说明16.参考以下附图和数据图表将更全面地理解本说明，这些附图和数据图表被呈现为本公开的各种实施例，并且不应被视为对本公开的范围的完整叙述，其中：17.图1是用于产生独特的等离子体核纳米粒子的示意图的示例性实施例，这些等离子体核纳米粒子然后用于产生等离子体荧光。在该示意图中，λlspr大于810nm的核心aunr可以用银涂覆，以产生主λlspr在650nm与800nm之间的aunr@ag；或者λlspr大于660nm且小于800nm的核心aunr可用于产生主λlspr在450nm与650nm之间的aunr@ag。18.图2是适用于增强可被460nm-500nm之间的光激发的荧光剂(诸如cy 2、fitc和alexafluor 488)的aunr@ag等离子体粒子的示例性实施例的在其最大值处归一化为1的消光光谱。19.图3是适用于增强可被480nm-540nm之间的光激发的荧光剂(诸如tritc、cy3、mb543和alexafluor 532)的aunr@ag等离子体粒子的示例性实施例的在其最大值处归一化为1的消光光谱。20.图4是适用于增强可被620nm-650nm之间的光激发的荧光剂(诸如cy5、alexafluor 633和ir dye 650)的aunr@ag等离子体粒子的示例性实施例的在其最大值处归一化为1的消光光谱。21.图5是适用于增强可被650nm-680nm之间的光激发的荧光剂(诸如cy 5.5、ir dye 680lt和alexafluor 680)的aunr@ag等离子体粒子的示例性实施例的在其最大值处归一化为1的消光光谱。22.图6是适用于增强可被750nm-790nm之间的光激发的荧光剂(cy 7.5、irdye 800cw和alexafluor 790)的aunr@ag等离子体粒子的示例性实施例的在其最大值处归一化为1的消光光谱。23.图7是表现出长斯托克斯位移的等离子体荧光体的示例性实施例。此处显示了两个示例，一个涉及单个fret对(供体荧光团和受体荧光团)，且一个涉及fret三联体，其中中间荧光团(供体2/受体1)充当初始供体荧光团(供体1)与最终受体荧光团(受体2)之间的桥梁。在任一种情况下，产生的等离子体荧光体都可以在激发最短波长供体荧光团的波长(λex_d)下被激发，并在最长波长受体荧光团的最大发射波长(λem_a)下最大程度地发射。24.图8是被470nm的光激发的长斯托克斯位移等离子体荧光体的两种示例性实施例的发射光谱图：一种等离子体荧光涂覆有fret对fitc-cy3，且另一种等离子体荧光体涂覆有fret三联体fitc-cy3-cy5。在这两种情况下，从最长波长的受体分子(fitc-cy3对中的cy3和fitc-cy3-cy5三联体中的cy5)观察到显著的荧光，且供体分子的荧光受到抑制，表明有效的fret。25.图9是使用aunr@ag等离子体核心粒子构建等离子体荧光体的示例性实施例。用间隔层覆盖aunr@ag等离子体核心粒子，然后荧光染料分子缀合至该间隔层。然后用功能层(在本例中为生物素化的牛血清白蛋白(bsa)和游离bsa的组合)涂覆该染料间隔层。任选地，可以通过附着链霉亲和素进一步修饰该生物素化的等离子体荧光体，然后可以任选地用生物素化的抗体修饰该链霉亲和素。26.图10是使用aunr@ag等离子体核心粒子构建等离子体荧光体的示例性实施例，其中用间隔层涂覆aunr@ag等离子体核心粒子，然后荧光染料分子缀合至该间隔层。然后用功能层涂覆该染料间隔层，在本例中为反式环辛烯(tco)bsa与游离bsa的组合。任选地，这种与tco缀合的等离子体荧光体可以进一步与四嗪(tz)缀合的抗体反应。tco和tz只是“点击”化学配对的一个示例，但是任何点击配对都可以起作用。27.图11是pmhc修饰的等离子体荧光体及其产生方法的示例性实施例。通过向含有过量生物素化的pmhc的溶液中加入链霉亲和素缀合的等离子体荧光体，可以使用链霉亲和素缀合的等离子体荧光提产生pmhc修饰的等离子体荧光体。具体实施方式28.通过结合如下所述的附图参考以下详细描述，可以理解本公开。应当注意，为了说明清楚，各图中的某些元件可能没有按比例绘制。本文介绍了设备的几种变型。应当理解，不同变型的各种组件、部件和特征可以组合在一起和/或彼此互换，所有这些都在本技术的范围内，然而附图中未示出所有变型和特定变型。还应当理解，各种变型之间的特征、元件和/或功能的混合和匹配在本文中被明确地考虑，使得本领域普通技术人员将从本公开中理解，除非另外描述，否则一种变型的特征、元件和/或功能可以根据需要结合到另一种变型中。29.现在将呈现适用于整个本公开的若干定义。如本文所用，无论是否明确指出“约”是指数值，包括整数、分数、百分比等。术语“约”通常指数值的范围，例如所述值的±0.5-1％、±1-5％或±5-10％，人们将认为其等同于所述值，例如，具有相同的功能或结果。30.术语“包括”是指“包括，但不一定限于”；它具体地表示在所述组合、组、系列等中的开放式包含或成员资格。文使用的术语“包括”和“包含”是包含性的和/或开放式的，并且不排除附加的、未引用的元件或方法过程。术语“基本上由……组成”比“包括”更具限制性，但不像“由……组成”那样具有限制性。具体地说，术语“基本上由……组成”限制了特定材料或步骤的成员资格，以及那些实质上不影响所要求保护的发明的基本特征的材料或步骤。31.如本文所用，术语“等离子体荧光体”或“荧光纳米构建体”是指在其核心具有至少一个等离子体纳米结构、涂覆等离子体纳米结构的间隔层和在其表面上缀合的至少一种荧光剂的复合材料结构。在一些变型中，“等离子体荧光体”或“荧光纳米构建体”可以进一步包括支架层和/或生物识别元件(例如，mhc、pmhc、链霉亲和素等)。32.如本文所用，术语“荧光剂”是指能够在激发时产生荧光发射的染料、荧光探针或荧光团。33.本文提供了超亮荧光纳米构建体，等离子体荧光体(pf)，其基于新型含银等离子体纳米构建体。此外，本文公开了表现出大斯托克斯位移(荧光团的激发光谱和发射光谱的最大值的位置之间的差异)的新型等离子体荧光体。等离子体荧光体可以缀合至一种或多种生物识别元件，并用于增强现有的生物测定。此外，这些等离子荧光体由于其卓越的亮度，可实现新的生物测定。本文公开的等离子体荧光体技术可以放宽仪器要求，因为它们比典型的有机荧光团亮得多(即，它们在给定的时间内发射更多的光子)。34.等离子体荧光体表现出长斯托克斯位移，使得激发与发射之间有明显的分离，并且是超亮的。通过使用波长检测更长的宽带激发源(例如led)，这可以实现更简单、更便宜的荧光检测系统。此外，可以使用相同的激发源激发许多不同的荧光团，并特别使用不同的带通滤波器或甚至单色仪检测每一个荧光团。这在高度多路复用荧光测定(诸如流式细胞术和免疫组织化学/免疫细胞化学)中尤其重要，其中一些荧光团用于特异性鉴定细胞群体，而其他荧光团用于提供关于这些群体内表达的蛋白质的信息。35.等离子体荧光体相对较大的表面积使其能够用许多生物识别元件官能化。生物识别元件可能包括但不限于mhc、pmhc、链霉亲和素、中性亲和素或亲和素。这导致结构的表观亲和力(或亲合力)高于单独的生物识别元件。对于可能希望靶向对靶标具有低亲和力但存在多个靶标的复合物的情况，诸如在鉴定抗原特异性t细胞的主要组织相容性复合体(mhc)测定中，这一点尤为重要。用负载有肽的mhc(pmhc)分子官能化的等离子体荧光体代表可用于识别t细胞受体的最灵敏试剂。这不仅是因为它们令人惊人的亮度，还因为它们能够以高密度负载大量pmhc。36.本公开涉及超亮荧光纳米复合材料或等离子体荧光体。荧光纳米复合材料可以包括具有至少一个局部表面等离子体共振波长(λlspr)的等离子体纳米结构、至少一个间隔涂层、至少一种具有最大激发波长(λex)的荧光剂和至少一个负载有肽的主要组织相容性复合体(mhc)分子(pmhc)。荧光纳米复合材料结构的荧光强度比单独的该至少一种荧光剂的荧光强度大至少500倍。37.在一些示例中，等离子体纳米结构是涂银的金纳米棒纳米结构(aunr@ag)，其被用作超亮荧光纳米构建体中的核心粒子。通常，认为金是针对具有高于600nm的主lspr峰的纳米结构(例如金纳米棒(aunr)选择的金属，并且对于低于600nm的主lspr峰，银是优选的。为了产生等离子体增强的荧光纳米粒子，银通常可能比金更优选，因为银具有比金更强的等离子体，并且可以支持多种等离子体模式。此处示出等离子体核心粒子(aunr@ag)，其具有约390nm至约800nm的可微调lspr峰，在表面上具有银作为金属，且在中心具有金纳米棒。银比金具有更强的等离子体，且当如所述掺入等离子体荧光体时，可产生更高的合成荧光。aunr上的银涂层会相对于原始aunr的主lspr峰对所得主lspr峰进行蓝移。一般来说，人们会选择主lspr波长比所得aunr@ag的靶标主lspr峰长100nm-400nm的aunr。由于aunr@ag纳米结构因银而具有多种等离子体模式，因此本文证明，即使是这些非优势等离子体模式也可用于增强缀合荧光团的荧光。38.如图1所示，通过用银涂覆具有较高lspr波长的金纳米棒，可以从金纳米棒(aunr)产生aunr@ag核心粒子，从而具有在460nm与800nm之间的主lspr峰。例如，要产生主lspr峰在750nm-800nm之间的aunr@ag，首先要产生lspr峰在1050nm-1200nm之间的aunr。另一个示例是，使用lspr为850nm-950nm的aunr，将会产生在510nm-680nm处具有主lspr峰的aunr@ag。另一个示例是，使用主lspr峰为640nm-700nm的aunr，将会在460nm-510nm处产生具有主lspr峰的aunr@ag。除了主lspr峰之外，还有显现出低至395nm的显著次lspr峰。39.在一个实施例中，至少一个λlspr与λex之间的差小于75nm。在至少一个示例中，aunr@ag的主lspr峰位于待增强荧光团激发最大值的50nm以内。图2-图6示出了鉴定出主导峰的消光光谱的示例和将用于产生所得等离子体荧光体的荧光团的示例。在另一个实施例中，aunr@ag的显著lspr峰在待增强的荧光团的激发最大值的50nm以内。例如，对应于图2-图5所示光谱的aunr@ag纳米结构可用于通过依赖于这些结构在390nm-410nm范围内的非主导lspr峰来增强以405nm激光激发的染料(诸如海水蓝)。40.通过在银过度生长步骤中调整硝酸银与金纳米棒的比率，完成了aunr@ag纳米结构的合成，其uv-vis光谱如图2-6所示。如图6所示，合成主导(主)峰在750nm-800nm之间的aunr@ag的示例性程序，对于lspr为1050nm的aunr，从380ml消光为0.228的10mm十六烷基三甲基氯化铵(ctac)中的aunr溶液开始，加入15.2ml的10mm硝酸银。将该混合物加热至60℃，且加入3.8ml的100mm抗坏血酸，快速混合，并在60℃下温育至少6小时。要制作具有不同lspr峰的aunr@ag，将遵循上述程序，仅改变化学组分(金纳米棒、ctac、硝酸银和抗坏血酸)的比率，同时从主lspr波长比所得aunr@ag的靶标主lspr峰长100nm–400nm的aunr开始。图2-图6示出了使用银过度生长程序产生的lspr峰范围为390nm至～800nm的aunr@ag的光谱。通常情况下，表面上含有银的纳米粒子在水溶液中容易氧化，从而可降低等离子体性质。制备用于产生荧光纳米结构(等离子体荧光体)的aunr@ag，并在1周内涂覆如下所述的间隔层，从而可保护aunr@ag免受氧化。这些粒子在水溶液中已被储存多于6个月，没有任何明显的氧化或等离子体性质的变化。41.使用aunr@ag作为等离子体荧光体中的核心等离子体粒子的优势在于其易于合成、其强等离子体以及其在常用荧光染料区域中的lspr波长的可微调性，但是应当注意，等离子体荧光体也可以使用能够在适当波长范围内支持等离子体共振的许多其他结构来产生，包括但不限于：金纳米棒、银纳米立方体、银或金纳米球、双金属纳米结构、金核银壳纳米立方体、金或银纳米管、金纳米棒、银纳米立方体、银纳米球体、具有尖锐尖端的纳米结构、纳米星、中空纳米结构、纳米笼、纳米拨浪鼓、纳米双锥、纳米板、纳米浆果。42.在一个实施例中，aunr@ag纳米结构充当等离子体荧光体的中心核心。然后，可用至少一个间隔涂层或间隔层涂覆aunr@ag纳米结构。例如，可用间隔层涂覆aunr@ag纳米结构，如图9和图10所示。该间隔层可以是任何能够涂覆到aunr@ag结构上并且具有精细可控厚度的介电材料。在一些实施例中，间隔涂层的厚度为约0.5nm至约20nm、约1nm至约10nm或约2nm至约5nm。43.理想情况下，间隔层具有允许荧光染料分子缀合的反应性基团，并且在涂覆后在溶液中保持稳定。示例性间隔层由使用(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(mptms)的引发层及生长层组成，该引发层结合银表面并允许生长附加硅烷层，该生长层含有三甲氧基(丙基)硅烷(tmps)和(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(aptms)的混合物。可以修改tmps与aptms的比率，以调整经涂覆纳米结构的ζ电位和表面上反应性基团的密度。例如，要用最佳间隔物厚度涂覆对应于图6所示光谱的aunr@ag颗粒，首先将400微升mptms加入到400ml aunr@ag在1mm ctac中的溶液中，其中aunr@ag的主lspr峰为约760nm，且消光为6-10。将该混合物在20℃下轻轻摇晃温育1小时。1小时后，加入2ml aptms和2ml tmps，混合，并且将该溶液在20℃下轻轻摇晃温育4小时。然后将这些间隔物涂覆的aunr@ag粒子离心并重新悬浮在1mm ctac中，以停止间隔涂层反应。作为另一个示例，为了涂覆对应于图3所示光谱的aunr@ag粒子，将遵循上面的精确步骤，但是将使用主lspr峰为约510nm且消光为45-50的aunr@ag。使用硅烷作为间隔层的基础是有吸引力的，因为厚度很容易通过简单地调整反应物的化学计量来控制尺寸。44.间隔物涂覆的aunr@ag纳米结构可直接缀合至至少一种荧光剂，如图9和图10的第二步所示。在各种示例中，该至少一种荧光剂可包括至少约5、至少约10、至少约20、至少约50、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400或至少约500种荧光剂。使用tmps和aptms作为间隔生长层会导致伯胺基团暴露于溶剂中，并且这些胺基团很容易被胺反应性荧光染料(例如含有n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯、异硫氰酸酯、四氟苯基(tfp)酯或五氟苯基(pfp)的那些)官能化。对于等离子体荧光体的合成，通常将会选择单一类型的荧光染料和适当的等离子体纳米结构核心，使得荧光染料的激发最大值在等离子体纳米结构的显著lspr峰的约50nm以内。例如，为了标记1ml消光为20并使用0.5x磷酸盐缓冲盐水溶解在1mm ctac中的对应于图6中光谱的间隔物涂覆的aunr@ag纳米结构，将添加浓度为5mg/ml的4微升溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中的nhs-磺基-氰化物7.5，并在室温下温育12小时。作为另一个示例，为了标记1ml消光为20并使用0.5x磷酸盐缓冲盐水溶解在1mm ctac中的对应于图3中光谱的间隔物涂覆的aunr@ag纳米结构，将添加浓度为5mg/ml的2微升溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中的染料nhs-mb543，并在室温下温育12小时。对于每种染料/纳米结构组合，可以根据经验找到最佳标记条件，但应选择为使随着染料浓度变化的每颗粒的荧光最大化。45.可以通过将多种不同类型的染料分子结合到等离子体荧光体中来产生具有大斯托克斯位移的光谱独特的等离子体荧光体。如图7所示，通过将染料分子结合到能够参与傅里叶共振能量转移(fret)的等离子体荧光体中，可以产生具有大斯托克斯位移的等离子体荧光体。具体来说，可以掺入荧光染料/试剂，其形成fret对、fret三联体、fret四联体，或甚至fret五联体。在一个优选实施例中，在fret链中第一供体染料分子(即具有最低激发波长的染料分子)的激发最大值附近和用于激发的光源附近，适当的纳米结构核将具有高摩尔消光，并因此具有局部共振等离子体模式。46.在一个实施例中，荧光纳米复合材料结构可以包括具有至少一个局部表面等离子体共振波长(λlspr)的等离子体纳米结构、至少一个间隔涂层、至少一种具有第一最大激发波长(λex1)和第一最大发射波长(λem1)的荧光剂、以及至少一种具有第二最大激发波长(λex2)和第二最大发射波长(λem2)的荧光剂。该荧光纳米复合材料结构可被λex1的光激发，并可在λem2处发光，使得λem2处的发射强度大于λem1处的发射强度。因此，该至少一种具有λex1的荧光剂是用作fret受体的该至少一种具有λex2的荧光剂的fret供体。在一些示例中，该至少一个λlspr与λex1之间的差小于100nm、小于75nm、小于50nm、小于25nm或小于15nm。47.在一些实施例中，荧光纳米复合材料可进一步适应fret三联体、四联体或五联体。例如，对于fret三联体，荧光纳米复合材料可进一步包括至少一种具有第三最大激发波长(λex3)和第三最大发射波长(λem3)的荧光剂。该荧光纳米复合材料结构可被λex1的光激发，并可在λem3处发光，使得λem3处的发射强度大于λem1或λem2处的发射强度。48.如图7所示，fret染料可缀合至厚度在1nm与10nm之间且优选在2nm-5nm以内的同一间隔层。替代地，如图7所示，fret染料可缀合至不同的间隔层，其中最短波长的供体染料缀合至第一间隔层，且受体染料缀合至覆盖第一间隔层且厚度在1nm与3nm之间的第二间隔层。这种逐层方案可以扩展到fret三联体、四联体或五联体。此外，可以将混合方案与逐层方案相结合。例如，可以仅用供体染料涂覆第一层，而用另一种染料对的混合物涂覆第二层，所述另一种染料对用作用于供体染料的fret受体和用于较长波长受体染料的供体。49.例如，用fret对fitc和cy3以1:1的化学计量比涂覆对应于图3所示光谱的间隔物涂覆的aunr@ag纳米结构，且图8示出该等离子体荧光体在470nm处被激发时的合成发射光谱。当在470nm处被激发时，这种等离子体荧光体在约520nm的fitc发射最大值处显示出抑制发射，而在约570nm的cy3发射最大值附近显示出强发射，这两者都指示有效的fret。在没有fitc作为供体分子的情况下，单独含有cy3的同一等离子体荧光体将被470nm光极轻微地激发。作为附加示例，对应于图3所示光谱的间隔物涂覆的aunr@ag纳米结构用fret三联体fitc、cy3和cy5以1:1:1的化学计量比涂覆，且图8还示出该等离子体荧光体在470nm被激发时的合成发射光谱。在该实施例中，fitc和cy3荧光两者都受制，而cy5荧光得到。在没有fitc的情况下，当在470nm被激发时，cy3-cy5粒子的荧光将是最小的。在没有cy3的情况下，由于fitc作为供体时fret效率很低，fitc荧光将受到最低程度的抑制，且cy5的荧光将是最小的。选择最佳标记化学计量以使供体染料荧光最小，同时使最终受体(即发射波长最长的染料)的荧光最大。通过匹配适当的纳米结构(即在最短波长供体的激发最大值(λex_d)附近具有显著lspr模式者)，选择适当的fret染料链以促进共振能量转移，并优化标记化学计量以使等离子体荧光体在fret染料链中最长波长受体染料的最大发射波长(λem_a)下的荧光最大化，同时抑制供体染料的荧光，可以产生许多光谱独特的长斯托克斯位移等离子体荧光体。下表1提供了染料链组合的示例，这些染料链组合可用于产生具有列1中给出的激发波长和发射波长的独特等离子体荧光体。本领域技术人员应该认识到，这些是非限制性的示例，且光谱相似(即在下面列出的染料的15nm以内具有激发最大值和发射最大值)的染料可以被替代以实现相同的效果。例如，如果标记化学计量被优化，则alexa488可以被fitc或cy2取代而没有显著差异。作为另一个示例，alexa546可被mb543、四甲基罗丹明或cy3取代。作为另一个示例，alexa633可以被cy 5或irdye 650取代。50.表1：对于长斯托克斯位移，等离子体荧光上的染料组成51.ꢀꢀꢀꢀꢀꢀex/em染料1染料2染料3染料4染料5405/445海水蓝ꢀꢀꢀꢀ405/530海水蓝alexa488ꢀꢀꢀ405/580海水蓝alexa488alexa546ꢀꢀ405/580海水橙ꢀꢀꢀꢀ405/615海水蓝alexa488cy3.5ꢀꢀ405/615海水橙cy3.5ꢀꢀꢀ405/660海水蓝alexa488alexa546alexa633 405/660海水橙cy3.5alexa633ꢀꢀ405/695海水蓝alexa488alexa546cy5 405/695海水橙cy3.5cy5ꢀꢀ405/725海水蓝alexa488alexa546cy5.5 405/725海水橙cy3.5cy5.5ꢀꢀ405/780海水蓝alexa488alexa546cy5cy7405/780海水橙cy3.5cy5.5cy7 488/530alexa488ꢀꢀꢀꢀ488/580alexa488alexa546ꢀꢀꢀ488/615alexa488cy3.5ꢀꢀꢀ488/660alexa488alexa546alexa633ꢀꢀ488/695alexa488alexa546cy5ꢀꢀ488/725alexa488alexa546cy5.5ꢀꢀ488/780alexa488alexa546cy5cy7 561/580alexa546ꢀꢀꢀꢀ561/615cy3.5ꢀꢀꢀꢀ561/660alexa546alexa633ꢀꢀꢀ561/695alexa546cy5ꢀꢀꢀ561/725alexa546cy5.5ꢀꢀꢀ561/780alexa546cy5cy7ꢀꢀ640/660alexa633ꢀꢀꢀꢀ640/695cy5ꢀꢀꢀꢀ640/725cy5.5ꢀꢀꢀꢀ640/780cy5cy7ꢀꢀꢀ52.在一些实施例中，等离子体荧光体可以进一步包括支架层。在一个示例中，在用荧光染料涂覆之后，制备等离子体荧光体的下一步可以是添加支架层。支架层有多种用途：当使用合适的封闭剂时，可防止免疫测定中的非特异性吸附；它稳定荧光染料标记的等离子体荧光体；并且它用作可以容易地从其缀合用于生物识别的靶向元件诸如生物素、链霉亲和素、核酸或抗体的碱基。支架层不是绝对必需的，因为可以将这些靶向元件直接附着到间隔层，但是支架层提供了附加标记多样性，并提高了等离子体荧光的稳定性。图9示出用于使用牛血清白蛋白(bsa)作为支架层产生抗体涂覆的等离子体荧光体的方法的一个示例。在此方法中，将荧光染料标记的等离子体荧光体与生物素化的bsa和天然bsa的混合物在超声下在溶液中温育约30分钟。通过将生物素化的bsa与天然bsa的比率从100％生物素化的bsa更改为1％生物素化的bsa，可以容易地调整标记密度。此外，可以使用胺反应性生物素化试剂(诸如nhs-peg 4-生物素)将生物素化的bsa的标记程度从1-10个生物素改变。通过调整生物素化的bsa与天然bsa的标记比率以及调整生物素化程度，使得能够令人难以置信地控制生物素在等离子体荧光体表面上的密度和分布。bsa支架层还可以使用戊二醛或另一合适的交联剂交联，以提高稳定性。53.在一个实施例中，等离子体荧光体可以进一步在间隔涂层和/或支架层上包括至少一个生物素结合分子。例如，至少一个生物素结合分子包括至少约2、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45或至少约50个生物素结合分子。生物素结合分子的非限制性示例包括链霉亲和素、中性亲和素和亲和素。例如，在用bsa/生物素化的bsa支架层涂覆后，等离子体荧光提可能对链霉亲和素具有功能反应性，并且可用于在生物测定中特异性检测链霉亲和素。它们也可以用链霉亲和素涂覆，产生链霉亲和素官能化的等离子体荧光体，其可用于在生物测定中特异性检测生物素化试剂。如图9所示，可以用另一种生物素化试剂(例如抗体)进一步修饰这些链霉亲和素涂覆的等离子体荧光体。作为另一个示例，生物素化的bsa可以用被“点击”化学反应性部分(例如通过nhs-tco试剂附着到bsa的反式环辛烯(tco)或通过nhs-四嗪附着到bsa的四嗪(tz)官能化的bsa代替，并且可以使用bsa:bsa-tco或bsa-tz的混合物形成支架层，如图10所示。本领域技术人员将认识到，可以使用任何点击反应性对来代替tco/tz，包括但不限于铜催化的点击反应中的叠氮化物-炔烃对。此外，通过将点击官能化的等离子体荧光体与用互补点击部分标记的靶向元件一起温育，可以将靶向元件(例如链霉亲和素、抗体、核酸等)缀合到点击官能化的等离子体荧光体，如图10所示。54.在一个实施例中，等离子体荧光体可以进一步在其外表面上包括至少一个负载有肽的mhc(pmhc)分子。在各种示例中，pmhc分子可以是生物素化的，并且生物素化的pmhc可以附着到间隔涂层和/或支架层上的生物素结合分子。该至少一个生物素化的pmhc分子可包括至少约2、至少约4、至少约8、至少约12、至少约16、至少约20、至少约24、至少约28、至少约32、至少约36、至少约40或至少约48个pmhc分子。与pmhc缀合的等离子体荧光体代表非常有吸引力的平台，用于鉴定抗原特异性t细胞的mhc四聚体测定或四聚体染色，这些t细胞含有特异性识别pmhc中负载的肽的t细胞受体(tcr)。在所谓的mhc-四聚体测定(又称四聚体染色)中，用于鉴定抗原特异性t细胞的标准试剂是与四个生物素化的pmhc分子结合的荧光标记链霉亲和素。单个pmhc-受体复合物具有相对弱的亲和力，因此，通过将四个pmhc分子经由链霉亲和素将其连接而组合在单一复合物中，亲和力增加，且因此表观亲和力增加。这一概念通过连接多个这些mhc-四聚体分子以产生例如pmhc十二聚体而得到了进一步的扩展。另一种方法是将pmhc附着到荧光标记的葡聚糖，形成所谓的葡聚糖。本文公开了用于产生用许多mhc分子(优选8-40个或更多)修饰的等离子体荧光体的方法和组合物。55.所得组合物具有优于现有材料的若干优点：1)等离子体荧光体本身比包括pe在内的传统荧光团亮至少50x，从而产生更高的信号；2)多个pmhc分子(至少12个)的存在提供了具有非常高的亲合力/表观亲合力的pmhc修饰的等离子体荧光体；和3)pmhc修饰的等离子体荧光体(最长尺寸》50nm)的物理尺寸允许在更大的面积上结合细胞表面受体，这意味着可以检测到具有较低受体密度的t细胞。在一些实施例中，等离子体荧光体的荧光强度比单独的荧光剂的荧光强度大至少50倍、大至少100倍、大至少200倍、大至少300倍、大至少400倍或大至少500倍。56.在一个示例性实施例中，通过将链霉亲和素缀合的等离子体荧光体加入到含有摩尔过量的生物素化的pmhc分子的溶液中，将链霉亲和素涂覆的等离子体性荧光体与生物素化的pmhc组合，可以组装pmhc修饰的等离子体性荧光体，其中摩尔过量是相对于如图11所示的含有链霉亲和素缀合的等离子体性荧光体的溶液中的链霉亲和素的摩尔浓度来确定的。pmhc修饰的等离子体荧光体可以通过离心从游离pmhc中分离出来。可在反应后离心前加入过量的游离生物素，以确保所有生物素结合位点均被占据，从而最大限度地减少任何可能的交联和聚集。在这种设计中，通过简单地改变用于制备等离子体荧光体的生物素化的bsa与bsa的比率，或者通过改变bsa的生物素化程度，或者同时改变两者，可以很容易地改变等离子体荧光体表面上的pmhc密度。这最终会改变等离子体荧光体表面上存在的链霉亲和素的数量。应当认识到，在这种情况下，bsa涂层作为支架，并可取代许多不同的蛋白质和其他可提供类似功能的聚合物。此外，可以使用(例如生物素-peg-硅烷)将生物素直接掺入硅烷间隔层中，或者可以通过暴露的胺添加生物素-peg-nhs酯，类似于荧光染料的缀合方式。在这种情况下，链霉亲和素可以直接通过这些生物素缀合，而不需要支架。57.在另一个实施例中，可以通过将含有反应性点击化学部分的等离子体荧光体与用互补点击部分标记的pmhc(例如，用tco-peg-nhs酯标记的等离子体荧光体和用四嗪-peg-nhs酯标记的pmhc)组合来组装pmhc修饰的等离子体荧光体。在这种情况下，peg起到间隔物的作用，以提高缀合效率，但也可以省略。peg的长度可以在2到24个单体单元之间)。在该“点击的”pmhc实施例中，首先用tco标记的bsa和游离bsa的混合物涂覆等离子体荧光体，其中tco-bsa的百分比可以在100％至约5％的范围内，并且理想地在80％至约10％之间。然后可以将这种tco-等离子体荧光体与摩尔过量的四嗪标记的pmhc分子一起温育。通过简单地改变tco-bsa与bsa的比率，可以改变等离子体荧光体表面上的pmhc密度。在另一个实施例中，mhc分子被设计成在c-末端或溶剂暴露环处具有未配对的半胱氨酸，并且通过巯氢基反应性试剂(例如马来酰亚胺-peg-tz或马来酰亚胺-peg-tco)将反应性点击部分添加到mhc分子。然后可以将其与互补的官能化等离子体荧光体缀合。58.通常，mhc分子在细菌培养物中表达，并包括生物素化标记，诸如bsp或avitag。在mhc分子纯化和重折叠后，用生物素连接酶诸如bira修饰该标签，其中生物素连接酶位点特异性地添加生物素分子。使用点击版本的等离子体荧光体，可以直接连接适当修饰的mhc分子。利用遗传密码扩展技术，可以将非典型氨基酸位点特异性地引入蛋白质中。使用这种策略，可以用含有点击反应部分的非典型氨基酸替代mhc分子中的至少一个天然氨基酸，例如c-末端区域。可以与tz官能化的等离子体荧光体反应的示例性氨基酸是tco*-l-赖氨酸(tco*-lys)，但是如果等离子体荧光体被适当的互补反应单元官能化，则可以使用任何具有点击官能团的氨基酸，诸如含叠氮基或炔烃的氨基酸。为了将点击反应性氨基酸结合到mhc分子中，仅将用稀有密码子(例如琥珀(tag)终止密码子)取代所需修饰位点处的天然密码子，并与垂直于宿主翻译机制的附加trna-trna合成酶对(trna-rs)一起表达蛋白质。trna合成酶的活性位点经过工程改造，仅接受特异性点击功能化非典型氨基酸，将其结合到识别稀有密码子的trna中。点击官能化的非典型氨基酸被简单地添加到生长培养基中，从而在特定位点结合到mhc蛋白中。这种方法的一个优点是消除了向mhc添加生物素连接酶识别序列，并消除了使用生物素连接酶的连接反应。这种相同的方法可以应用于点击官能化抗体和其他生物表达分子，然后将它们缀合到互补的点击官能化等离子体荧光。59.本文还提供了一种鉴定具有特异性t细胞受体的t细胞的方法。在一个实施例中，该方法可以包括提供含有t细胞的样品，使含有t细胞的样品与荧光纳米复合材料结构接触，在空间上分离t细胞，用将诱发荧光发射的波长的光激发荧光纳米复合材料结构，以及检测用荧光纳米复合材料结构标记的t细胞。在一些实施例中，可以使用流式细胞术对t细胞进行空间分离。60.荧光纳米复合材料结构可以含有至少一个负载有肽的主要组织相容性复合体(mhc)分子(pmhc)，其可以特异性结合含有对肽具有特异性的受体的t细胞。在一些实施例中，荧光纳米复合材料结构包括具有至少一个局部表面等离子体共振波长(λlspr)的等离子体纳米结构、至少一个间隔涂层和至少一种具有最大激发波长的荧光剂。荧光纳米复合材料结构的荧光强度比单独的该至少一种荧光剂的荧光强度大至少500倍。61.实例62.实例1：链霉亲和素官能化的等离子体荧光体的制备63.将1ml在用lspr波长下消光为20的荧光剂标记的等离子体荧光体离心，以形成沉淀物。除去990μl上清液。在单独的微量离心管中，将200μl生物素化的bsa溶液(相对于待涂覆的等离子体属荧光体，至少100x摩尔过量)加入到适当的缓冲液(如ph 9的50mm碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液)中。将整个等离子体荧光体沉淀物转移到生物素化的bsa溶液中，并在水浴中超声处理30分钟。将其从声波水浴器中取出，并将溶液在4℃下培养15小时。将生物素化的bsa涂覆的等离子体荧光体溶液离心形成沉淀物，然后除去除10μl以外的所有上清液。在一个单独的微量离心管中，将200μl链霉亲和素溶液(相对于待涂覆的等离子体荧光体至少50x摩尔过量)加入适当的缓冲液(如ph 9的50mm碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液)中。将整个沉淀物生物素化的bsa涂覆的等离子体荧光体转移到链霉亲和素溶液中，并温育2小时。将该溶液离心形成沉淀物，并除去上清液。将其重新悬浮在适当的缓冲(例如ph 9的50mm碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，含1％bsa)液中。将此再重复两次，以除去未结合的链霉亲和素。64.实例2：pmhc官能化的等离子体荧光体的构建65.将类似于实例1的链霉亲和素官能化的等离子体荧光体(strep-pf)调整至在其lspr波长消光为20，并且取出1ml且置于微量离心管中。将该溶液离心以沉淀出strep-pf，并除去约990μl的上清液。在另一个微量离心管中，将400μl的8μm(368μg/ml肽-mhc i复合体或232μg/ml肽-mhc ii)溶液加入到相容的缓冲液中，例如在冰上ph为7.4的1x pbs(磷酸盐缓冲盐水)。将全部离心的strep-pf沉淀物转移至mhc肽复合体溶液中，并且将此涡旋10s，然后在4℃温育2小时。可直接使用该反应，或者任选地通过添加摩尔过量的生物素阻断该反应，然后使用。66.实例3：基于平板的测定，确认等离子体荧光体被pmhc官能化67.确认等离子体荧光体已与pmhc缀合的简单方法是针对mhc部分进行免疫测定。这是通过在pbs中用1μg/m浓度的对mhc部分具有特异性的抗体(抗β2-微球蛋白或抗mhc类特异性抗体)涂覆微量滴定板来完成的。然后用合适的封闭剂(如1％bsa在1x pbs中)封闭平板，并用合适的洗涤剂(如含0.05％tween 20的1x pbs)洗涤。然后将一定量的含有与pmhc缀合的等离子体荧光体的溶液在平板中温育10分钟，取出，并且用合适的洗涤剂洗涤平板。然后使用合适的读数器检测平板表面上的等离子体荧光体荧光，并且与未涂覆对mhc部分具有特异性的抗体的微量滴定板的对照孔进行比较。由于当肽未结合时，mhc复合体将会迅速解离，因此该程序确保了pmhc复合体为官能活性的。68.实例4：鉴定能够识别特异性肽的t细胞群69.制备目的细胞(例如cd8阳性t细胞)，并且将2x106个细胞加入96孔微量滴定板孔的微量离心管中。用适当的细胞染色缓冲液(例如1x pbs，含5％的胎牛血清)将体积调节至200μl。加入2μl的pmhc-官能化的等离子体荧光体溶液，类似于实例2，其中pmhc含有目的肽，并在冰上在黑暗中温育30分钟。针对染色缓冲液洗涤细胞两次，且重新悬浮在200μl染色缓冲液中。使用具有适当设置的流式细胞仪分析细胞，以检测所用等离子体荧光体的特异性荧光信号。为了获得最佳性能，可能需要滴定pmhc官能化的等离子体荧光体的浓度。70.已经描述了几个实施例，本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神的情况下，可以使用各种修改、替代构造和等同物。此外，为了避免不必要地模糊本发明，没有描述许多众所周知的方法和元件。因此，以上描述应被解释为说明性的，而不是对本发明范围的限制。下面的权利要求旨在覆盖本文描述的所有一般和具体特征，以及本发明方法和组合物范围的所有陈述，就语言来说，它们可能落入其之间。