共振纳米光子生物传感器

本发明涉及光学生物传感器。

背景技术：

1、核酸、蛋白质、小分子和全病原体测试对于生物体和生态系统健康的预测、检测、监测和治疗是关键的。例如，呼吸面板识别指示如流感和冠状病毒的传染病的抗原、抗体、核酸和全病原体特征；核酸和循环肿瘤细胞标识癌症并且被用于指导治疗；并且在环境样品中发现的核酸和小分子指示海洋、淡水、牲畜、土壤和空气的健康状况。最常见的是，使用诸如逆转录酶聚合酶链反应(reverse-transcriptase polymerase chain reaction，rt-pcr)、分子信标和dna微阵列之类的技术对核酸序列进行标识和分析；同样地，使用elisa或横向流动测定检测蛋白质和小分子。然而，这些技术要么缓慢且敏感(例如，rt-pcr、elisa)，要么快速且不精确(例如，横向流动测定)。用于快速分析患者样品中的生物标记物的、并且可以在护理点工作的新颖的方法是必要的。理想地，这些方法还可以符合世界卫生组织的assured指南(负担得起的、敏感的、特定的、用户友好的、稳健的和快速的、无装备的、对需要它们的人是可递送的)。

技术实现思路

1、我们开发了一种新技术，该技术使用光学表征来快速且定量地测量：1)dna或提取的病毒-rna目标结合、2)抗体结合、3)全病原体(即，全病毒或细菌)结合、和/或4)到纳米制造平台上的小分子结合。

2、我们可以检测从sars-cov-2基因组中提取的用于对不同的蛋白质进行编码的病毒-rna基因序列，不同的蛋白质包括包膜蛋白、rna依赖性rna聚合酶、以及同时形成病毒核衣壳且无需扩增的蛋白质。我们还可以从血清样品中检测抗体，这些抗体包括igg、igm和iga。我们还可以从痰液或唾液中检测全病毒或细菌结合。我们的技术还可以被扩展到covid-19以外的其他病毒或细菌感染，被扩展到类似于癌症、过敏原或神经系统疾病的其他疾病，并且还被扩展到检测农业或环境设置中存在的疾病和毒素。

3、我们的平台依赖于高品质因子(“高q”)纳米结构化介电基板，其称为超表面(metasurface)，生成具有高灵敏度的共振散射强度，该灵敏度与吸附的生物标记物负载成比例。超表面用受体进行功能化，并且暴露于患者样品，以从用例如鼻咽、口腔/粘膜拭子、血清学样品、血液、或唾液/呼吸样品进行病毒感染测试的患者确定对应的病毒负载。

4、随后，超表面用激光或发光二极管来照亮，并且透射或反射的入射光的光学读出提供对核酸、抗体或全病原体目标的定量、灵敏和实时监测，而不需要感兴趣的基因/抗体的逆转录、扩增或标记。我们快速且灵活的抗原和抗体测试技术易于部署、制造并适用于新的传染性病原体。我们的技术承诺检测的极限可与当前的定量rt-pcr和elisa测定相当，速度可与横向流动测定相当。

5、高q超表面设计：

6、我们利用被称为超表面的纳米结构化硅表面来从患者样品中检测目标抗原标记物。超表面用微型、片上激光二极管或发光二极管照亮，并且散射强度提供了片段化病毒rna、抗体或全病原体浓度的定量测量。通过依靠自由空间共振超表面，我们克服了横向流动测定通常较低的信噪比，并促进了使用现成的消费电子级相机传感器。在其他材料上使用纳米图案化硅表面也保证了该测定的可扩展性和成本效益；值得注意的是，它允许我们利用成熟的cmos制造工艺及其独特的大规模、低成本制造优势。

7、2020年11月4日提交的美国专利申请17/089384中考虑了高品质因子(高q)衍射光学超表面，并且通过引用将其全部内容并入本文中。这些超表面包括纳米天线阵列，这些纳米天线阵列可以被设计为同时捕获并由此放大光以及操纵光散射到远场的方式。捕获能力(其是感测的关键)是通过构建由透明、高折射率材料(诸如硅)制成的单个天线来实现的，使得它们支持导模共振(guided mode resonance，gmr)。衍射光谱示出了在近红外波长处可见的急剧下降，其表示gmr。光学共振的寿命由品质因子(q)表征，通过将中心频率除以其光谱宽度来测量。通过仔细调整几何形状，我们可以确保共振在数千个光学周期内捕获光，从而产生入射光强度的等效的倍增。除了在时间上压缩光之外，超表面还将光挤压到非常小的体积中。将这些效应综合起来会产生一种基板，它的散射对抗原核酸片段和抗体的存在响应非常敏感。

8、高q超表面读出：

9、我们的超表面内的高品质因子模式针对敏感目标检测给出了关键的信号放大。因此，我们可以直接地读出散射(透射或反射)的强度。重要的是，由于每个纳米天线都独立于其邻居，因此多重检测是可能的。

10、我们的超表面还可以实现灵敏的拉曼光谱，以用于对全病原体进行特定检测。此处，超表面被设计成在泵浦波长(pump wavelength)处具有高q模式，在斯托克斯偏移波长(stokes-shifted wavelength)处具有更宽的q模式。替代地，可以将一系列高q模式定位在斯托克斯位移波长处，其中病原体的特征可以被预测。

11、最后，我们的超表面本质上是色散的。由于我们的超表面是在操作波长～100-1000nm的尺度上进行设计的，它们可以有效地衍射散射光。在我们先前的实验中，我们证明了我们可以独立于高q超表面共振而系统地调谐该衍射曲线。由于强烈的结构色散，我们可以简单地通过使用ccd或cmos相机对元曲面进行成像来在空间上分离各种散射波长。这种光学色散将揭示关于抗体或病原体的高分辨率光谱信息，而不需要诸如光谱仪和光谱ccd之类的笨重、昂贵的光学组件。

12、用于核酸/抗原检测的超表面功能化：

13、超表面平台的化学功能化依赖于超表面的共价硅烷化，例如，(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(aptms)或11-氨基十一烷基三乙氧基硅烷(autes)。随后，与m-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺(mbs)酯交联的胺-巯基被用于附接与当前rt-pcr测定中使用的基因序列e、n2、orflab和5'utr互补的硫醇化dna探针。通过用三甲氧基(丙基)硅烷(ptms)稀释aptms自组装单分子层，dna探针浓度和表面密度可以被调谐，以用于与rna片段的最高效率杂交。这种经由硅烷化进行充分研究的表面功能化方法已经被我们验证为可重现和可控的寡核苷酸附接。

14、用于抗体测试的超表面功能化：

15、抗体测定的表面功能化目前利用6步骤过程。在反映抗原表面化学的前两个步骤后，我们用两性离子单层聚乙二醇(peg)化基质对表面进行功能化，该基质被优化以用于最小化非特定吸收。该基质由两个分子的优化的比率组成，2-{2-[2-(1-巯基-11-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基次氮基三乙酸(hs-c11-(eg)3-nta)和(2-[2-(2-[11-氢硫基-十一烷氧基)-聚氧乙烯]-聚氧乙烯)-聚氧乙烯]-聚氧乙烯)-二甲基铵)醋酸盐，其中的第一个最终会与我们感兴趣的抗体结合，而第二个会增加单层的密度。与氯化镍盐一起的随后的孵育可与nta分子结合。随后，这种ni(ii)-nta复合物使sars-cov-2刺突蛋白的rbd区域能够与我们的超表面结合。刺突蛋白已被多组氨酸标签修饰，这增加了刺突蛋白对金属离子的亲和力，并且从而增加了其与单层ni(ii)-nta复合物的结合亲和力。重要的是，这种功能化定位抗体识别位点，从而允许与我们的初级抗体结合的可能性增加。

16、我们将芯片放置在密封的保持器中，该保持器允许在没有污染的情况下引入液体患者样品(鼻咽拭子以及血清样品)，并同时进行光学询问和读出。

17、显著的优点被提供。与现有的抗原测试相比，我们的测定提供了若干项优势：1)近乎瞬时的读出(我们目前使用30ms采集)；因此，结合样品处理(例如，病毒基因片段化)，我们的测定可以在护理点<15分钟内提供抗原结果。2)由于芯片激光锐散射光谱，检测的极限极低；初步实验指示1000cp/ml的灵敏度。3)通过依靠纳米图案化硅，我们利用建立的高通量cmos制造工艺的低成本和可扩展制造。4)荧光标记或次级抗体不被需要；因此，用户在收到我们的产品后不需要任何试剂。5)由于表面的“自由空间”照明和我们的生物打印功能化，在单个芯片上的大规模多重抗原和抗体测试是可能的。6)我们的基板在清洗后是可重复使用的。7)需要最少的使用培训，不像pcr或elisa需要实验室技术人员或医疗保健专业人员。我们计划在医疗保健系统中拥有庞大的客户群，包括医生/诊所、紧急护理设施和医院；从长远来看，在家进行测试可以被部署。