一种低噪声固态纳米孔的制备方法

本发明属于分子检测及测序，其具体涉及一种低噪声固态纳米孔的制备方法。

背景技术：

1、随着纳米科学技术的发展，基于纳米孔的传感器已成为能够对生命体关键组成部分进行单分子分析的杰出工具，生命体关键组成部分包括对生命和医疗起着至关重要作用的核酸、蛋白质、聚糖和大量生物分子。因固态纳米孔的孔径可控、具有良好的环境适应性、化学稳定性和可规模化制备及集成性等优点，固态纳米孔被认为是生物纳米孔的有效替代者。但是，固态纳米孔的高噪声干扰仍然是制约其用于dna测序最严重的问题，探索降低固态纳米孔噪声的方法，研究低噪声固态纳米孔的制备方法对固态纳米孔技术的研究突破具有重要的意义。

2、目前，透射电镜电子束、聚焦离子束和介电击穿法是三种常用的制备小孔径薄膜纳米孔的加工技术，但因电子束/离子束所需设备极为昂贵、实验室条件要求苛刻，限制了相应制备方法的适用范围。现有固态纳米孔的降噪方案的薄膜覆盖层均采用先光刻再转移的工艺，即先在聚合物薄膜上光刻开窗，再转移覆盖到氮化硅薄膜上，最后在聚合物窗口位置制备氮化硅纳米孔，其覆盖层的厚度和开孔面积受光刻、转移工艺的影响，不能完整的覆盖氮化硅薄膜表面。

3、如果预先在氮化硅薄膜上悬涂一层聚合物覆盖层，再进行双层材料固态纳米孔的直接加工，从而使氮化硅薄膜未击穿部分全部被聚合物覆盖，实现尽量减小电解质溶液与氮化硅薄膜表面接触的目的，将会极大的降低纳米孔的整体电容和检测噪声。目前常用的制备小孔径薄膜纳米孔的加工技术(透射电镜电子束、聚焦离子束和介电击穿法)不能满足双层材料固体薄膜的加工，并且双层材料固体薄膜的加工对介电击穿法固态纳米孔制备提出了超高电场加工需求——施加电场必须达到氮化硅薄膜的击穿需求才能实现纳米孔制备，导致聚合物覆盖层会被同时置于远高于自身击穿电场的超高电场下，这样超高电场也会导致聚合物覆盖层自身被击穿的严重后果。

技术实现思路

1、基于现有技术介电击穿法施加电场不能高于固体薄膜击穿电场的问题，本发明提供一种低噪声固态纳米孔的制备方法，其能够在各种类型的薄膜基材、尤其是多层材料的薄膜基材上一次性制备各种孔径的固态纳米孔器件，尤其能够同平台实现低噪声纳米孔的制备和单分子测试，其广泛用于纳米孔单分子检测、纳米孔测序等领域。

2、依据本发明技术方案的第一方面，提供一种低噪声固态纳米孔的制备方法，其包括低噪声纳米孔加工步骤和纳米孔测试步骤，低噪声纳米孔加工步骤包括以下步骤：

3、步骤s1，纳米薄膜芯片制备，在薄片上构建双层材料固体纳米薄膜芯片；

4、步骤s2，微流控芯片组装，根据双层材料固体薄膜芯片的外观尺寸，设计加工多层结构的具有微流道的芯片；

5、步骤s3，加工参数设置，根据双层材料固体薄膜的厚度和材料介电常数，设置恒流源系统的输出电流和输出电压，用于制备小孔径的固态纳米孔；

6、步骤s4，固态纳米孔制备，依据步骤s3设置的加工参数，采用超高电场制备固态纳米孔。

7、其中，纳米孔原位测试步骤为在上述制备的低噪声纳米孔上进行纳米孔原位测试，其包括以下步骤：

8、步骤w1，将电源表替换为多通道纳米孔电流测试系统，测试纳米孔孔径，确保纳米孔的测试性能和指标满足要求；

9、步骤w2，将多通道蠕动泵前端的缓冲溶液替换为待检测样品溶液；

10、步骤w3，单分子检测：待测溶液在多通道蠕动泵的驱动下，注入到固态纳米孔的其中一端，在偏置电场的作用下以单个分子的形式陆续通过固态纳米孔，形成可以采用膜片钳记录的离子电流信号；

11、步骤w4，基于步骤w3中的记录的纳米孔过孔电流，对样品测试进行信号存储与分析。

12、进一步地，步骤s1中，直接在具有tem窗的氮化硅薄膜上悬涂厚度低于80nm的pmma覆盖层，形成由pmma覆盖层和氮化硅薄膜构成的双层材料固体薄膜芯片。

13、进一步地，步骤s1中，构建双层材料固体纳米薄膜。

14、优选地，根据双层材料固体薄膜芯片的外观尺寸，设计加工3层结构的具有微流道的芯片。

15、优选地，将双层材料固体薄膜芯片安装在微流控芯片的中间层，进行固定贴合；安装完成后接入溶液管路，控制缓冲溶液进入到固体薄膜的下端公共流道层，缓冲溶液与双层材料固体薄膜的下方完全接触，直至缓冲溶液流出微流道出口与公共电极连接。

16、优选地，微流控芯片上端溶液管路和电极接入到微流控芯片上端溶液入口，但不注入缓冲溶液，待设置好加工参数，开启直流电源后再根据设置后的加工参数注入缓冲溶液。

17、优选地，根据双层材料固体薄膜的厚度和材料介电常数，设置恒流源系统的输出电流5na，输出电压为纳米薄膜层对应的击穿电场的1～5倍，用于制备小孔径的固态纳米孔。

18、更优选地，采用预先设置的低噪声纳米孔可控制备流程，在微流控芯片上施加超高电场(1.5*ebd)制备固态纳米孔。

19、依据本发明技术方案的第二方面，本发明的一种低噪声固态纳米孔的制备方法，其采用基于微流控的固态纳米孔局域可控制备系统。该系统通过微流控系统和微流控芯片中的纳米微针，精确控制纳米微针尖端溶液与固体薄膜的接触位置和接触时间，实现局域可控制备固态纳米孔。微流控的固态纳米孔局域可控制备系统包括微流控芯片、多通道蠕动泵、溶液软管、多层固体纳米薄膜、电极、电源表和处理系统；其中

20、微流控芯片用于安装固定固态纳米孔芯片、精确控制固态纳米孔两侧溶液和加注待测样品；

21、多通道蠕动泵用于控制微流控芯片内溶液的流量和加注缓冲溶液、待测样品的种类；

22、溶液软管用于连接缓冲溶液、待测样品溶液瓶与微流控芯片间的溶液管路，以及提供接入电极的三通接头，软管内溶液的流量和体积受多通道蠕动泵的精确控制；

23、多层固体纳米薄膜用于制备固态纳米孔，多层固体纳米薄膜为固态纳米孔的原始基材，当受到纳米微针的局域电场刺激后被击穿，形成多层材料的固态纳米孔；

24、电极用于连接缓冲离子溶液与电源表或者纳米孔测试电路，确保离子溶液与电极界面间的离子交换顺畅；

25、电源表用于提供可调控的稳压电源或者恒流源；当进行纳米孔过孔电流测试时，电源表被替换为多通道膜片钳检测系统，用于实时记录固态纳米孔的过孔电流；

26、处理系统用于程控电源表或者纳米孔测试电路，提供与用户交互的图形界面，实现电源表施加电流电压的实时控制、纳米孔孔径的测试和单分子过孔信号的检测等功能。

27、与现有技术相比较，本发明的低噪声固态纳米孔的制备方法具有以下技术效果或有益效果：

28、1、本发明基于微流控微液滴接触法，精确控制纳米薄膜上方微液滴接触的时间和位置，实现加工固态纳米孔加工位置和速度的控制。

29、2、本发明采用局域可控介电击穿法，能够使用高于材料击穿电场数倍的电场加工固态纳米孔，具有同时加工不同材料薄膜的性能，提供了一种直接加工双层或多层固态纳米孔的新方法。

30、3、本发明纳米微针控制溶液与纳米薄膜微接触，接触面积小，提升了固态纳米孔检测的信噪比和通量，即能够实现每个纳米微针通道单独制备纳米孔和检测。

31、4、采用本发明原位制备固态纳米孔，仅需要更换缓冲溶液前端的试剂，即可以实现检测样品的更换，解决了常用纳米孔检测系统更换溶液步骤繁琐，用量大的问题，是一种边制备边测试的高通量纳米孔制备、测试系统。