一种改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法与流程

本发明涉及生物分析，具体涉及一种改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法。

背景技术：

1、寡核苷酸药物是由人工化学合成的寡核苷酸单链或双链组成的一类药物，通过碱基互补配对作用于mrna。不同于天然核酸，寡核苷酸药物通过对寡核苷酸的磷酸骨架或糖残基进行化学修饰以减少其被核酸酶水解。

2、寡核苷酸药物具有特殊的结构特点，其因亲水性强、富含游离的磷酸基团而呈电负性。因此，在使用离子对色谱法进行检测时，该类化合物在色谱分离过程中易与色谱柱筛板、固定相、进样器、管路等发生非特异性吸附。尤其是在进行组织分布研究时，固体组织匀浆后的组织样本中蛋白含量低，这种非特异性吸附变得更加明显。因此，在进行组织匀浆样本分析方法建立时，常常遇到峰形拖尾严重、校正标样低点浓度偏低或高点浓度偏高的非线性关系以及残留大等问题，这些问题导致方法开发难度高、残留大、准确度差、灵敏度低的现象。

3、现有技术中，截止目前的研究，对于色谱柱吸附带来的残留大的问题仍没有一个很好的解决方法，lakshmi ramanathan和pei li的研究中，通过每进样250～300和1000～2000针更换一根新色谱柱去消除残留带来的影响，该方法成本较高；anthony t.murphy通过缩减线性范围(80倍线性范围)来减少影响，然而，非特异吸附带来的残留影响并没有得到实质性消除或减弱。

4、因此，本领域亟需一种吸附性小、峰形对称且残留小、重现性高的改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，所述方法包括如下步骤：

2、s1、将待测肝脏样本制备为待测匀浆样本，加入前处理液并涡旋混合，之后加入clarity otx buffer并涡旋混合，所述前处理液由动物粪便和粪便匀浆液组成；

3、s2、向s1中得到的溶液里加入is内标工作液并涡旋混合，之后再加入醋酸铵缓冲液涡旋混合，制备得到上样溶液；

4、s3、对固相萃取板进行活化和平衡后，取所述上样溶液作为待测样本进行上样，之后清洗固相萃取柱，最后使用洗脱液进行洗脱，洗脱完成后在氮气条件下吹干并使用0.05％的chaps和5mmol/l tcep水溶液复溶；

5、s4、将s3得到的溶液进样于高效液相色谱-串联四极杆质谱仪，在电喷雾离子化方式下进行定量分析检测。

6、具体地，所述前处理液中，动物粪便为犬粪便、猴粪便、大鼠粪便或小鼠粪便中的一种，所述粪便匀浆液为clarity otx lysis buffer或匀浆混合液。

7、具体地，所述匀浆混合液包括甲醇和pbs缓冲液。

8、具体地，所述pbs缓冲液的浓度为15mmol/l，所述甲醇和pbs缓冲液的体积比为1:1.5～1:9。

9、具体地，所述前处理液的制备过程中，所述动物粪便和粪便匀浆液的重量比为1:5～1:20，所述动物粪便和粪便匀浆液在湿冰条件下匀浆，得到的混合液在800×g、4℃条件下离心5min，取上清液即得到前处理液。

10、具体地，s1中，所述前处理液的添加量至少为待测匀浆样本的体积的40％。

11、具体地，s3中，所述活化的活化试剂为甲醇，所述平衡的平衡试剂为50mmol/l、ph值为5.5的醋酸铵缓冲液。

12、具体地，s3中，所述清洗固相萃取柱是指使用醋酸铵缓冲液、醋酸铵缓冲液与乙腈的等体积混合液依次清洗固相萃取柱，所述醋酸铵缓冲液的浓度为50mmol/l，所述醋酸铵缓冲液的ph值为5.5。

13、具体地，s3中，所述洗脱液由碳酸氢铵水溶液、乙腈、四氢呋喃和0.25mol/l tcep的水溶液组成，所述碳酸氢铵水溶液的浓度为1.00mol/l，所述碳酸氢铵水溶液、乙腈、四氢呋喃和0.25mol/l tcep的水溶液的体积比为1:4:1:4。

14、具体地，s4中，所述液相色谱质谱定量分析检测的检测条件为：液相色谱仪为沃特世acquity超高效液相色谱系统；质谱仪为sciex triple quadtm 6500+；色谱柱为watersacquitytm premier peptide beh c18,2.1*100mm,1.7μm；流动相a是含0.1％ dbaa和0.2％ hfip的水/meoh(v/v,95:5)溶液；流动相b是含0.2％ dbaa和0.2％ hfip的乙腈/水(v/v,95:5)溶液。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

16、1.本发明提供的检测方法，其中前处理液的制备过程简单，且仅通过在样本前处理时加入，就可以有效减少吸附带来的影响，峰形对称，可以得到更宽的线性范围，从而满足不同剂量下样本的检测。

17、2.本发明提供的检测方法，克服了现有技术线性差、色谱峰拖尾以及残留大的缺陷，检测得到的峰形中，拖尾现象得到明显改善，线性得到显著提升，残留率明显降低，降低检测限的同时还保证了较好的检测准确度。

技术特征：

1.一种改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，其特征在于，所述前处理液中，动物粪便为犬粪便、猴粪便、大鼠粪便或小鼠粪便中的一种，所述粪便匀浆液为clarity otx lysis buffer或匀浆混合液。

3.根据权利要求2所述的改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，其特征在于，所述匀浆混合液包括甲醇和pbs缓冲液。

4.根据权利要求3所述的改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，其特征在于，所述pbs缓冲液的浓度为15mmol/l，所述甲醇和pbs缓冲液的体积比为1:1.5～1:9。

5.根据权利要求1所述的改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，其特征在于，所述前处理液的制备过程中，所述动物粪便和粪便匀浆液的重量比为1:5～1:20，所述动物粪便和粪便匀浆液在湿冰条件下匀浆，得到的混合液在800×g、4℃条件下离心5min，取上清液即得到前处理液。

6.根据权利要求1所述的改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，其特征在于，s1中，所述前处理液的添加量至少为待测匀浆样本的体积的40％。

7.根据权利要求1所述的改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，其特征在于，s3中，所述活化的活化试剂为甲醇，所述平衡的平衡试剂为50mmol/l、ph值为5.5的醋酸铵缓冲液。

8.根据权利要求1所述的改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，其特征在于，s3中，所述清洗固相萃取柱是指使用醋酸铵缓冲液、醋酸铵缓冲液与乙腈的等体积混合液依次清洗固相萃取柱，所述醋酸铵缓冲液的浓度为50mmol/l，所述醋酸铵缓冲液的ph值为5.5。

9.根据权利要求1所述的改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，其特征在于，s3中，所述洗脱液由碳酸氢铵水溶液、乙腈、四氢呋喃和0.25mol/l tcep水溶液组成，所述碳酸氢铵水溶液的浓度为1.00mol/l，所述碳酸氢铵水溶液、乙腈、四氢呋喃和0.25mol/l tcep水溶液的体积比为1:4:1:4。

10.根据权利要求1所述的改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，其特征在于，s4中，所述液相色谱质谱定量分析检测的检测条件为：液相色谱仪为沃特世acquity超高效液相色谱系统；质谱仪为sciex triple quadtm 6500+；色谱柱为watersacquitytmpremier peptide beh c18,2.1*100mm,1.7μm；流动相a是含0.1％dbaa和0.2％hfip的甲醇水溶液；流动相b是含0.2％dbaa和0.2％hfip的乙腈水溶液。

技术总结本发明公开了一种改善寡核苷酸药物色谱行为的液相色谱质谱检测方法，在前处理过程中加入前处理液，结合固相萃取等前处理步骤对样本进行前处理，完成液相色谱质谱检测，所述前处理液由动物粪便和粪便匀浆液组成。本申请提供的检测方法，通过制备并加入前处理液的步骤，有效减少了吸附带来的影响，峰形对称，可以得到更宽的线性范围，从而满足不同剂量下样本检测需求，本方法克服了现有技术线性差、色谱峰拖尾以及残留大的缺陷，检测得到的峰形中，拖尾现象得到明显改善，线性得到显著提升，残留率明显降低，降低检测限的同时还保证了较好的检测准确度。技术研发人员：安培云,卢金莲,吴小鹏,邢丽丽,陶怡,沈良受保护的技术使用者：南京药明康德新药开发有限公司技术研发日：技术公布日：2024/7/23