一种LC-MS/MS同时检测血浆中原醛症相关5种类固醇激素的方法

本发明涉及分析检测，尤其涉及一种lc-ms/ms同时检测血浆中原醛症相关5种类固醇激素的方法。

背景技术：

1、原发性醛固酮增多症（pa，简称原醛症）是一种会导致体内血容量增多、潴钠排钾且会使肾素-血管紧张素系统活性受到抑制的病症，会对患者肾脏、心脏等高血压靶器官产生严重损害。所以，针对原醛症的早期、准确诊断及治疗至关重要，而原醛症不同分型适用的治疗方式截然不同。原醛症共有6种分型，其中特发性醛固酮增多症（iah）和肾上腺醛固酮腺瘤（apa）的总占比为95%，前者手术效果不佳，优选药物治疗，而后者推荐单侧肾上腺切除术，目前分型的金标准是双侧肾上腺静脉采血（avs），该技术有创、复杂，技术要求高，国内可开展的医疗机构很少，极大妨碍了原醛症患者的准确分型及有效治疗，寻找一种无创分型手段是目前关注热点。有研究显示，醛固酮瘤的18-羟皮质醇（18-ohf）、18-氧皮质醇（18-oxof）、18-羟皮质酮（18-ohb）的含量均高于特发性醛固酮增多症，直接测定血浆中上述物质的含量可在一定程度上辅助分型，使得一部分患者免于avs操作。同时有研究指出，皮质醇和醛固酮联合检测能更早明确高血压肾损害患者病情。

2、在已经报道的针对原醛分型的检测方法中，缺少联合皮质醇、醛固酮的联合检测以及对检测体系的准确度、精密度、特异性等方面的方法验证及评价。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、由于本发明所述的5种类固醇激素在人体内的含量较低，尤其是18-氧皮质醇，血浆中含量极低，且在检测时易有干扰，因此检测难度较大。现有技术中，专利cn 117368347a公开了一种同时测定血浆中原发性醛固酮增多症分型标志物的液相色谱-串联质谱法，能够同时检测血浆中18-ohb、18-ohf和18-oxof。但本发明发现，上述方法并不能适用于同时检测18-羟皮质醇、18-氧皮质醇、18-羟皮质酮、醛固酮和皮质醇5种物质，18-氧皮质醇的检测低限不能满足临床的检测需求，且18-羟皮质醇出现杂质的干扰，因此存在进一步改善空间。

2、经过大量研究，本发明意外发现，前处理沉淀剂中甲醇比例能够对检测结果的响应值产生显著影响，通过优化沉淀剂中甲醇的浓度能够通过提高沉淀后过固相萃取板后各物质的响应值，以提高同时检测的5种类固醇激素的检测灵敏度、准确度和精确度，进而能够将外周血原醛分型指标及醛固酮、皮质醇联合检测，这有助于一次采样同时分析患者原醛可能及后续分型。

3、基于此，本发明具有如下技术方案。

4、第一方面，本发明首先提供一种lc/ms-ms同时检测血浆中原醛症相关5种类固醇激素的前处理方法，包括：s1：将检测样本与内标混液进行混合，加入沉淀剂和磷酸水溶液，得到混合溶液；s2：将所述混合溶液进行离心，而后将离心得到的上清液进行固相萃取处理，得到待测样品；其中，所述沉淀剂为0.1~0.2m的硫酸锌溶液，其通过35~45vol％的甲醇水溶液配制得到；所述5种类固醇激素为18-羟皮质醇（18-ohf）、18-氧皮质醇（18-oxof）、18-羟皮质酮（18-ohb）、醛固酮（ald）和皮质醇（cor）。

5、本发明发现，通过控制沉淀剂中甲醇的浓度为上述范围时，能够显著提高沉淀后过固相萃取板后各物质的响应值，进而提高检测效果，有助于同时检测血浆中原醛症相关的上述5种类固醇激素。

6、作为优选，所述沉淀剂中甲醇的浓度为38~42vol％，具体可以选择38vol％、39vol％、40vol％、41vol％或42vol％；进一步优选地，所述沉淀剂中甲醇的浓度为40vol％。

7、作为优选，s1中，所述检测样本与所述沉淀剂的体积比为1.5~1.7：1。

8、作为优选，s1中，所述磷酸水溶液的浓度为0.01~0.1vol％。

9、作为优选，s1中，所述检测样本与磷酸水溶液的体积比为3.5~4.5：3。

10、作为优选，s1中，所述内标混液包括18-ohf-d4、18-ohb-d4、cor-d4和ald-d8，其中18-oxof与18-ohf共用内标18-ohf-d4。

11、作为优选，s1中，所述检测样本与所述内标混液的体积比（10~20）：1；进一步优选地，体积比为20：1。

12、本发明中，所述检测样本为血浆时，优选取血浆样本优选400μl，内标混液20μl。

13、作为优选，s2中，所述固相萃取包括：s21：活化固相萃取板：依次加入甲醇和水并进行抽滤；s22：上样：取所述上清液进行抽滤；s23：淋洗：依次加入乙腈水溶液和正己烷并进行抽滤；s24：洗脱：使用乙腈洗脱，而后进行氮吹并使用乙腈水溶液复溶，得到待测样品。

14、作为优选，s2中，所述固相萃取板采用oasis prime hlb μelution columnplate；更优选地，固相萃取板采用96-well oasis prime hlb μelution column plate(milford waters, ma, usa)。

15、进一步优选地，s2中，所述固相萃取包括如下步骤：s21：活化固相萃取板：依次加入甲醇和水并进行缓慢抽滤；s22：上样：取所述上清液进行缓慢抽滤；s23：淋洗：依次加入4.5~5.5vol%乙腈水溶液和正己烷并进行抽滤；s24：洗脱：使用乙腈洗脱，而后进行氮吹并使用15~25vol%乙腈水溶液复溶，得到待测样品。

16、作为本发明的一种优选技术方案，所述lc/ms-ms同时检测血浆中原醛症相关5种类固醇激素的前处理方法包括：s1：将检测样本与内标混液进行混合，加入沉淀剂，涡旋20~40s，而后继续加入磷酸水溶液，4500~5500rpm混匀震荡3~7min，得到混合溶液；s2：将所述混合溶液在14000~16000rpm下进行离心7~12min，而后将离心得到的上清液进行固相萃取处理，得到待测样品；其中，所述沉淀剂为0.1~0.2m的硫酸锌溶液，其通过35~45vol％的甲醇水溶液配制得到；所述5种类固醇激素为18-羟皮质醇（18-ohf）、18-氧皮质醇（18-oxof）、18-羟皮质酮（18-ohb）、醛固酮（ald）和皮质醇（cor）。

17、第二方面，本发明提供一种lc-ms/ms同时检测血浆中原醛症相关5种类固醇激素的方法，包括使用所述的前处理方法进行处理后得到待测样品，而后将所述待测样品通过lc/ms-ms进行检测。

18、作为优选，液相色谱检测条件中，流动相a为0.01~0.05vol％甲酸水溶液；流动相b为乙腈，其中含有0~0.01vol%的甲酸。

19、更优选地，流动相a为0.01~0.05vol％甲酸水溶液；流动相b为乙腈。

20、进一步优选地，流动相a为0.01vol％甲酸水溶液；流动相b为乙腈。

21、液相色谱的洗脱程序为：

22、；

23、其中，%代表体积百分比，且流动相a的体积百分比与流动相b的体积百分比和为1。

24、本发明发现，使用该洗脱程序能够有效地将血浆样本中18-ohf的干扰峰分开，减少基质分析物中杂质的干扰。

25、进一步优选地，液相色谱的洗脱程序为：

26、；

27、其中，%代表体积百分比。

28、作为优选，色谱柱为色谱柱为pfp柱。

29、更优选地，色谱柱为acquity uplc hss pfp column (100mm × 2.1mm, 1.8μm)。

30、作为优选，流速为0.3~0.4ml/min。

31、进一步优选为0.35ml/min。

32、作为优选，质谱检测条件包括：

33、。

34、优选地，离子对参数如表1所示：

35、表1

36、。

37、第三方面，本发明提供所述lc/ms-ms同时检测血浆中原醛症相关5种类固醇激素的方法在原醛分型的区别鉴定方面的应用。

38、第四方面，本发明提供所述lc/ms-ms同时检测血浆中原醛症相关5种类固醇激素的方法在原醛症、皮质醇增多症的同时筛查诊断方面的应用。

39、本发明中的检测方法包含物质中除了18-羟皮质醇、18-氧皮质醇以及18-羟皮质酮外，增加了对血浆中醛固酮、皮质醇的检测，可同时对原发性醛固酮增多症进行初筛和辅助分型，也可同时判断皮质醇增多症的可能性，有助于两种内分泌性高血压同时筛查。

40、本发明基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测血浆中的18-羟皮质醇、18-氧皮质醇、18-羟皮质酮、醛固酮、皮质醇，在原发性醛固酮增多症（pa）分型的诊断中具有很大的应用前景，对于内分泌性高血压初步查因及辅助原醛分型具有重要的意义。

41、基于上述技术方案，本发明的有益效果在于：

42、本发明通过优化沉淀剂中甲醇的浓度能够通过提高沉淀后过固相萃取板后各物质的响应值，能够满足方法验证过程中对专属性、准确度、精密度等方面的要求，实现血浆样本中18-羟皮质醇、18-羟皮质酮、18-氧皮质醇、皮质酮和醛固酮的有效检测。