一种用于阿尔茨海默病诊断的多指标定量检测试剂盒的制作方法

本技术涉及生物技术诊断，具体地涉及一种用于阿尔茨海默病诊断的多指标定量检测试剂盒。

背景技术：

1、阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，ad）是一种起病隐匿的进行性发展的神经退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。

2、阿尔茨海默病是最常见的神经退行性疾病。随着人口老龄化，痴呆已成为老年人的常见病，其中阿尔茨海默病(ad)痴呆占60%～80%，是老年人失能和死亡的主要原因。阿尔茨海默病防治是一个世界性难题，首要原因在于难以早期诊断。我国痴呆患病人数占全球1/4，由于语言文化及种族特质与西方不尽相同，加上磁共振成像(mri)、正电子发射计算机断层显像(pet)和血液生物标志物等早期诊断技术并未广泛应用，综合医院门诊早期痴呆诊断率仅0.1%。

3、阿尔茨海默病临床表现为认知功能渐进性下降，伴有严重的记忆丧失，最终导致生活不能自理，阿尔茨海默病的病理特征主要表现为细胞外β-淀粉样蛋白（β-amyloid, aβ）沉积形成的斑块、细胞内异常过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结、突触丢失和神经元变性。

4、β淀粉样蛋白是由淀粉样前体蛋白经 β-和 γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39～43个氨基酸的多肽。它可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，大多与伴侣蛋白分子结合，少数以游离状态存在。人体内aβ最常见的亚型是aβ40和aβ42。aβ42具有更强的毒性，且更容易聚集，从而形成aβ沉淀的核心，引发神经毒性作用。

5、tau蛋白是一种在神经元中表达的微管相关蛋白，其主要生理功能是促进微管的组装及稳定已组装的微管。tau蛋白是一种磷蛋白，其正常生理功能受其磷酸化修饰的调控。tau蛋白的磷酸化状态受催化磷酸化的蛋白激酶和催化去磷酸化的蛋白磷酸酯酶的调节。正常生理条件下，磷酸化作用和脱磷酸化作用保持平衡。异常过度磷酸化使得tau蛋白除失去促进微管组装和稳定微管结构的生理功能外，还使得tau蛋白容易聚集形成毒性分子，并聚集形成神经原纤维缠结。

6、aβ和tau蛋白是临床常用的阿尔茨海默症检测生物指标，但是单项生物标志物不能全面反映临床病理现象，临床实践中需要结合多个检测指标和他们之间的关系，才能对阿尔茨海默症的临床诊断起到辅助诊断作用。根据《中国阿尔茨海默病痴呆诊疗指南》推荐联合检测以下项目：aβ42浓度，aβ40浓度，t-tau浓度，p-tau181浓度，并计算aβ42/aβ40比值，p-tau181/t-tau比值。

7、因此临床急需一种能够通过血液生物标志物早期诊断阿尔茨海默症的检测试剂盒。现有技术中多指标的检测试剂盒一般包括底板和设置在底板上的样品垫、检测垫、吸水垫等。检测垫上通常设置有包被有多指标的特异性捕捉抗体的多指标检测线和包被有可以与对应指标的特异性检测抗体结合的半抗原或抗体的质控线。但是现有的多指标检测垫通常是将多个指标设置在同一检测垫，然而这种设置结构并没有考虑到，当多指标之间存在高度相似性或相似性时，联检会导致交叉干扰，导致会影响最终检测结果的可信度。而针对于阿尔茨海默症的多个检测指标之间就存在上述所存在的问题。因此，有必要设计一种新的针对于阿尔茨海默症诊断的定量检测试剂盒。

技术实现思路

1、针对上述存在的技术问题至少之一，本实用新型目的是提供一种用于阿尔茨海默病诊断的多指标定量检测试剂盒，将t-tau和p-tau181，aβ42与aβ40两对指标分开检测，提高了检测的特异性，结果准确。

2、本实用新型的技术方案是：

3、本实用新型的目的在于提供一种用于阿尔茨海默病诊断的多指标定量检测试剂盒，所述的多指标包括t-tau、p-tau181、aβ42与aβ40四个指标，所述的试剂盒包括检测卡和样本稀释液；

4、所述检测卡包括底板和设于所述底板上的滤血垫、两块样品垫、两块结合垫、两块检测垫和两块吸水垫；

5、两所述检测垫相对且间隔地设置在所述底板的两端，任一所述检测垫的中间位置平行间隔设有一条质控线和两条检测线，任一所述检测垫的两端上方分别叠设有一个吸水垫和一个结合垫且两所述结合垫相对、两所述吸水垫相背；

6、两所述样品垫相对且间隔地叠设在两所述结合垫的相互靠近的一端上方，所述滤血垫叠设在两所述样品垫的上方；

7、其中一块所述检测垫上的两条检测线的其中一条检测线包被有t-tau和p-tau181的其中一个指标的特异性捕捉抗体、另一条检测线包被有aβ42与aβ40的其中一个指标的特异性捕捉抗体，另一块所述检测垫上的两条检测线的另一条检测线包被有t-tau和p-tau181的另一个指标的特异性捕捉抗体、另一条检测线包被有aβ42与aβ40的另一个指标的特异性捕捉抗体，两块所述检测垫上的质控线包被有可以与对应的两条检测线上的特异性检测抗体结合的半抗原或抗体；任一结合垫朝向其对应的检测垫的一面上涂设有时间分辨荧光微球或量子点标记的对应两指标的特异性检测抗体涂层。

8、优选地，所述检测卡还包括外壳，所述外壳的顶面设有一个加样孔和两个检视窗。

9、优选地，所述加样孔对应所述滤血垫的上方设置；

10、两所述检视窗一一对应于两所述检测垫的两条检测线和一条质控线的正上方设置。

11、优选地，任一所述检视窗在其对应的所述检测垫上的正投影面积大于或等于由所述两条检测线、一条质控线及其之间的间距所限定的区域的面积。

12、优选地，所述滤血垫、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫之间粘贴固定。

13、优选地，任一所述检测垫上的两条检测线位于该所述检测垫上的质控线的同侧。

14、优选地，任一所述检测垫上的质控线与靠近其的一条检测线之间的间距和两条检测线之间的间距相等。

15、优选地，其中一检测垫上的质控线与靠近其的一条检测线之间的间距、该检测垫上的两条检测线之间的间距和另一条检测垫上的质控线与其靠近的一条检测线之间的间距以及该检测垫上的两条检测线之间的间距均相等。

16、优选地，所述样品垫、结合垫和滤血垫的材质为玻璃纤维或无纺布，所述检测垫的材质为硝酸纤维素膜，所述吸水垫的材质为吸水滤纸，所述底板的材质为pvc。

17、与现有技术相比，本实用新型的优点是：

18、本实用新型的用于阿尔茨海默病诊断的多指标定量检测试剂盒，采用中间进样、两侧层析的技术方案，将t-tau和p-tau181，aβ42与aβ40两对指标分开检测，提高了检测的特异性，结果准确。相比于传统方案（四个指标单独检测），本实用新型的方案一次检测四个指标，节省了操作人员的时间、将四个检测卡的制造成本节省为一个，只占用仪器一个检测插口，提高同时检测通量，同时一次加样出四个结果，免去了四次加样之间的人员操作误差，因为最终医学参考还要计算aβ42/aβ40比值，p-tau181/t-tau比值，如果四次加样之间人员操作误差较大，最终比值差异可能会影响医学判断。本试剂可以在15分钟内同时对上述四个指标进行定量检测，操作简单，灵敏度高，特异性强，结果准确。适合在医院门急诊及基层医疗机构使用。