一种特异性识别器件及其制备方法与应用

本发明涉及生物技术、dna纳米技术、癌细胞成像及免疫检查点特异性抑制领域，尤其涉及一种特异性识别器件及其制备方法与应用。

背景技术：

1、细胞膜受体参与细胞周期、增殖、通讯和迁移等多种生物过程，具有重要的生命功能，是调节生理和病理状态的重要靶标。通过采用特异性结合膜受体的配体作为识别分子，人们开发出了许多靶向策略，并在实时分子成像、靶向给药、特异性蛋白质降解、生物大分子动态操控和增强免疫调节等方面得到了广泛应用。然而，在生物体内，大多数细胞膜受体通常为多种类型的细胞所共有，在病变细胞和正常细胞中均有过表达。因此，单一受体靶向策略可能会导致脱靶效应和严重的并发症。

2、dna分子计算结合了多种生物标记分析和逻辑门控操作，为减轻单一靶标的脱靶效应和提高细胞识别特异性提供了一种极具吸引力的解决方案。通过指数富集配体系统进化（selex）生成的适配体具有特异性强、亲和力高、易于化学合成和修饰等显著优点，被认为是靶向细胞膜受体的强大分子工具。使用适配体作为识别分子，通过结合诱导的链置换反应将双重或多重生物标记物的表达转化为dna信号，并传递给后续的布尔逻辑运算。因此，逻辑门控的计算结果可以实现更精确的细胞识别。除了适配体之外，纳米抗体参与分子计算也将极大地扩展分子计算工具箱，提高对错综复杂的细胞环境的感知、响应和操纵性能，从而受益于抗体在分子识别和生物调控方面的多种功能。然而，与可通过结构切换策略作为信号转换器的适配体相比，由于纳米抗体的“永远在线”响应模式和不便于分子编程，让纳米抗体参与dna分子计算是相当困难的。此外，对于某些功能性膜受体来说，与配体结合会立即激活下游信号通路，从而扰乱目标系统运行，使逻辑运算过程失效。因此，多层dna分子计算通常需要严格的识别顺序和配体生物功能屏蔽，以实现对特定膜受体的精确靶向和功能调控。

3、免疫检查点cd47在体内不同的细胞类型中广泛表达，通过与信号调节蛋白α（sirpα，表达于髓系细胞和神经细胞中）结合而发挥正常的生理功能，影响着红细胞、血小板和造血干细胞的稳态平衡，并维持着良性细胞的免疫耐受。然而，cd47在肿瘤细胞中高度表达，当它与巨噬细胞上的sirpα结合时，通过激活“别吃我”信号来逃避巨噬细胞的吞噬清除作用，cd47抗体可阻断癌细胞与巨噬细胞之间的cd47/sirpα信号传导，消除“别吃我”信号，促进吞噬作用。因此免疫检查点cd47在免疫疗法中受到广泛关注。鉴于cd47在正常细胞和血细胞中普遍存在，因此不加区分地阻断cd47-sirpα不能有效地靶向细胞，还会在体内引起抗体沉默效应，从而不可避免地造成正常组织损伤、贫血和血小板减少症等副作用。因此，目前迫切需要开发一种新的特异性靶向cd47的诊断及治疗策略，通过和肿瘤细胞表面的其他特异性靶点结合而避开与正常组织和血液系统中cd47的结合，降低cd47靶点相关毒性。

4、因此，基于适配体识别的dna分子计算结合了多种生物标记分析和逻辑门控操作，具有减轻单一靶标的脱靶效应和提高细胞识别特异性等特性，可发展一种具有严格识别顺序和配体生物功能屏蔽的特异性识别器件，通过和肿瘤细胞表面的其他特异性靶点结合来实现cd47的特异性靶向，降低cd47靶点相关的脱靶效应及毒副作用。因此，本项目旨在利用核酸适配体实现癌细胞的精准身份识别及cd47纳米抗体的特异性靶向，有望在肿瘤细胞混合群体及血液样本中实现癌细胞的痕量识别和个性化免疫点治疗，为疾病的精准诊疗提供了有应用价值的策略。

技术实现思路

1、针对现有技术中cd47抗体应用中识别特异性低、毒副作用大的缺陷，本发明提供了一种可携带纳米抗体的特异性识别器件及其制备方法与应用以克服上述缺陷，具体技术方案如下：

2、本发明首先提供了一种可携带纳米抗体的特异性识别器件，其特征在于：包括：

3、dna纳米笼，所述dna纳米笼为双链dna组成的多面体；

4、负载链，所述负载链为通过互补配对连接在dna纳米笼内部并将纳米抗体负载在dna纳米笼内部的单链dna；

5、核酸适配体，所述核酸适配体为通过碱基互补配对连接在dna纳米笼外侧的单链dna，所述核酸适配体可与细胞膜受体蛋白特异性结合；

6、互补短链，所述互补短链为与核酸适配体以及负载链互补配对的单链dna；

7、所述核酸适配体与细胞膜受体蛋白特异性结合时，所述互补短链脱离核酸适配体，所述脱离的互补短链可与负载链互补配对使负载链释放出负载的纳米抗体。

8、进一步地，所述dna纳米笼为由12条dna链组成的立方体；所述dna纳米笼各条棱的核苷酸序列如seq id no.1~12所示。

9、进一步地，所述负载链通过与dna纳米笼的棱碱基杂交连接在dna纳米笼的内部对角线上；所述负载链核苷酸序列如seq id no.15所示。

10、进一步地，所述纳米抗体以纳米抗体-dna偶联物的形式负载在dna纳米笼内部，所述dna偶联物与负载链互补配对；所述dna偶联物核苷酸序列如seq id no.16所示。

11、进一步地，所述核酸适配体和互补短链构成特异性识别纳米爪连接在dna纳米笼的外侧的一角；所述互补短链在核酸适配体背离dna纳米笼的一端与核酸适配体通过碱基互补配对相连接。

12、进一步地，所述核酸适配体核苷酸序列如seq id no.13或如seq id no.20所示；所述互补短链如seq id no.14所示。

13、进一步地，所述核酸适配体核苷酸序列如seq id no.22所示；所述互补短链如seqid no.23所示。

14、进一步地，所述负载链上负载有纳米抗体，所述纳米抗体为cd47纳米抗体。

15、本发明还提供了一种所述的特异性识别器件的制备方法，包括以下步骤：

16、s1：纳米抗体与单链dna发生化学交联反应生成纳米抗体-dna偶联物（nb-s）；

17、s2：12条dna单链和1条负载链通过程序退火自组装形成dna纳米笼（dna cage），s1中得到的纳米抗体-dna偶联物通过dna杂交负载进dna纳米笼的空腔内形成cage-nb；

18、s3：核酸适配体与互补短链构成特异性识别纳米爪，s2中负载有纳米抗体-dna偶联物的dna纳米笼cage-nb与识别纳米爪组装构成所述特异性识别器件，即dna纳米噬菌体（dnp）。

19、进一步地，s1具体为：cd47纳米抗体与双官能团小分子nh2-peg-n3在谷氨酰胺转氨酶催化下生成nb-peg-n3，随后nb-peg-n3与dbco修饰的单链dna(dbco-s)发生反应生成cd47纳米抗体-dna偶联物（nb-s）。

20、进一步地，核酸适配体与互补短链（aptamer/c-aptamer）分别修饰上荧光基团和猝灭基团，cd47纳米抗体-dna偶联物（nb-s）和负载链（sf）上分别修饰上荧光基团fam和猝灭基团dabcyl。

21、进一步地，dna纳米噬菌体（dnp）与特异性细胞膜受体蛋白接触时，核酸适配体-互补短链与膜蛋白结合，aptamer结合介导的链置换反应释放互补链（c-aptamer），将生物输入信号转换为下游dna信号，转换后的dna链c-aptamer可以扩散到笼子保护的内部计算核心，执行基于dna链置换的分子计算，释放cd47纳米抗体-dna偶联物nb-s特异性结合膜蛋白cd47。

22、进一步地，单价或多价dna纳米噬菌体（dnp1或dnp2）中核酸适配体-互补短链为sgc8c/c-sgc8c（靶向酪氨酸激酶7，ptk7）。当相应的受体蛋白ptk7存在时，sgc8c与ptk7形成核酸适配体-蛋白复合物，释放互补链c-sgc8c，将生物输入信号转换为下游dna信号，转换后的dna链c-sgc8c进入dna纳米噬菌体的内部进行dna分子计算，释放效应器nb-s来特异性结合膜蛋白cd47。

23、进一步地，多重dna纳米噬菌体（dnp3）中核酸适配体-互补短链为sgc8c/c-sgc8c（靶向酪氨酸激酶7，ptk7）和sgc4f/c-sgc4f（靶向几种白血病细胞上未知的过表达标记）。当相应的两种受体蛋白同时存在，核酸适配体-互补短链形成核酸适配体-蛋白复合物，释放互补链c-sgc8c和c-sgc4f，将生物输入信号转换为下游dna信号，转换后的dna链c-sgc8c和c-sgc4f进入dna纳米噬菌体的内部进行dna分子计算，释放效应器nb-s来特异性结合膜蛋白cd47。

24、更进一步地，所述的核酸适配体与互补短链（aptamer/c-aptamer）为sgc8c/c-sgc8c和sgc4f/c-sgc4f。当特异性识别器件为dnp1和dnp2时，其识别趾为sgc8c/c-sgc8c，当特异性识别器件为dnp3时，其识别趾为sgc8c/c-sgc8c和sgc4f/c-sgc4f。其中sgc8c/c-sgc8c分别修饰荧光基团tamra和猝灭基团bhq2，sgc4f/c-sgc4f分别修饰荧光基团cy5和猝灭基团bhq3。

25、更进一步地，本发明存在3种类型的特异性识别纳米爪（claw1、2、3），其中claw1识别纳米爪的序列为sgc8c-17/c-sgc8c(不存在接头序列)，claw2识别纳米爪的接头序列为y01+y02+y03，claw3的识别纳米爪的接头序列为y01-4f+y02+y03。

26、本发明还提供了一种所述的特异性识别器件在肿瘤细胞痕量检测中的应用。

27、本发明还提供了一种所述的特异性识别器件在免疫检查点特异性抑制中的应用。

28、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

29、（1）本发明利用谷氨酰胺转氨酶通过间接标记的策略获得cd47纳米抗体-dna偶联物（nb-s），与传统的抗体标记策略相比，此方法操作简单、反应条件温和且反应效率高；

30、（2）本发明中所设计的cd47纳米抗体-dna偶联物（nb-s）可以通过dna杂交封装进dna纳米笼的空腔内，有效屏蔽了纳米抗体的生物功能。从而避免了cd47纳米抗体与正常组织和血液系统中cd47结合，降低cd47靶点相关毒性；

31、（3）本发明所设计的基于dna纳米笼-cd47纳米抗体的特异性识别器件可识别多种细胞膜表面的特异性膜受体，通过执行严格的识别顺序和逻辑运算来释放cd47纳米抗体，以实现对靶细胞上膜蛋白cd47的精确靶向和功能调控。与传统的cd47单克隆抗体相比，通过和肿瘤细胞表面的其他特异性靶点结合而提高了对靶细胞上膜蛋白cd47特异性结合，有效降低了脱靶效应及毒副作用。