基于脂代谢组学分析评价药物调控代谢途径的方法

本发明属于中药研究，具体涉及一种基于脂代谢组学分析评价药物调控代谢途径的方法。

背景技术：

1、糖网病(diabetic retinopathy，dr)根据dr患者的眼底改变可分为非增殖期与增殖期，增殖期dr的标志是视网膜缺氧导致新血管生成。dr的发病机制复杂，主要有氧化应激、非酶糖化、蛋白激酶激活、多元醇途径激活、己糖胺途径激活发病机制。目前，激光治疗和玻璃体内注射抗-vegf疗法治疗该病的效果显著，但存在诸多并发症。中医药在糖网病防治方面有着丰富的临床实践经验，辨证论治和整体观是中医诊治糖网病的核心内容。目前，治疗dr较为困难，所以寻找有效防治和缓解dr的药物是关键。

2、胰腺功能降低、胰岛素分泌相对不足是糖尿病及其并发症的病理根源。其中胰岛β细胞功能障碍是糖尿病发病的核心环节。因此，糖网病的理想治疗策略是在降低血糖的同时保护胰岛功能。胰岛β细胞功能随着疾病持续时间逐渐恶化，从而引起脂代谢紊乱。脂代谢紊乱是糖网病发生和发展的重要标志，持续高血脂水平所产生的脂毒性可导致高活性反应分子性氧簇和活性氮簇生成增多，因此启动氧化应激机制，损伤胰岛β细胞，加重胰岛素抵抗，继而影响糖代谢。因此调控胰岛功能是治疗糖网病的最有效办法。传统脂代谢研究仅采用有限的病理及生化指标，仅关注糖网病脂代谢标记物分析，未能将其与整体药效评价有效关联，不能体现中药整体作用特征。且早期的传统药物评价研究多数仅关注给与正常动物后的生化指标，少数研究在疾病动物模型进行，但药物的实际效果与药物整体治疗作用相关联，研究结果与整体药效相脱节。

3、代谢组学是以代谢过程终产物为研究对象的高通量组学技术之一，用于解释其代谢表型特征，是研究生物体被扰动后其代谢产物种类、数量及动态变化规律的科学。代谢组学技术可从整体上综合分析生物样品中的内源性代谢物及代谢途径变化，可快速、精准地筛选潜在生物标志物，分析机体状态。脂质组学分析主要用于定性定量分析机体内源性物质，对特征性脂代谢生物标志物进行全面和系统的轮廓分析，这与中医“整体观”原则契合，其研究原理尤其适用于对代谢性疾病的研究，为阐明药物作用及其机制提供了重要的技术保障。因此，本发明意图通过脂代谢组学分析方法来评价药物在糖网病模型动物体内的整体代谢途径，从而为治疗糖网病的药物的研究提供新模式。

技术实现思路

1、鉴于上述技术问题，本发明提供一种基于脂代谢组学分析评价药物调控代谢途径的方法，以胰腺组织脂代谢标记物及代谢途径为参数，构建基于靶向调控糖网病胰腺组织脂代谢的药效机制研究范式，突破了传统药物评价方法确认药效的技术瓶颈，解决了现有方法评价药效周期长及效率低下的问题。

2、本发明提供的具体技术方案如下：

3、本发明提供一种基于脂代谢组学分析评价药物调控代谢途径的方法，包括以下步骤：

4、构建模型动物，取部分模型动物进行给药处理；

5、收集正常动物、模型动物及给药动物的离体胰腺组织，对胰腺组织中的代谢物进行检测分析；

6、对提取得到的代谢物进行检测分析，对比正常动物与模型动物胰腺组织中的代谢物，筛选出模型动物胰腺组织生物标志物；将模型动物胰腺组织生物标志物与给药动物胰腺组织中代谢物进行对比，筛选出给药动物胰腺组织生物标志物；

7、对上述给药动物胰腺组织生物标志物进行通路分析，得到药物调控脂代谢的代谢通路数据。

8、优选地，胰腺组织中代谢物的分析是采用液相色谱-质谱进行，分析条件为：

9、高效液相色谱条件：

10、色谱柱：acquityhss t3，2.1×100mm,1.8μm；0.3ml/min的流速；

11、正离子模式，流动相，b1：0.1％甲酸乙腈溶液(即在乙腈中加入甲酸至其体积分数为0.1％)，a1：0.1％甲酸水溶液(即在水中加入甲酸至其体积分数为0.1％)；梯度洗脱程序为：0～1min，8％b1；1～8min，8％～98％b1；8～10min，98％b1；10～10.1min，98％～8％b1；10.1～12min，8％b1；

12、负离子模式，流动相，b2：乙腈，a2：5mm甲酸铵水溶液(即在水中加入甲酸铵至其体积分数为0.1％)；梯度洗脱程序为：0～1min，8％b2；1～8min，8％～98％b2；8～10min，98％b2；10～10.1min，98％～8％b2；10.1～12min，8％b2；

13、其中，％为体积分数；

14、质谱条件：电喷雾离子源，正负离子模式采集；正离子喷雾电压为3.50kv，负离子喷雾电压为-2.50kv，鞘气40arb，辅助气10arb；毛细管温度325℃。以分辨率60000进行一级全扫描，一级离子扫描范围m/z 100～1000，并采用hcd进行二级裂解，碰撞能量为30％，二级分辨率为15000。

15、优选地，所述模型动物为糖网病模型动物。

16、优选地，模型动物胰腺组织生物标志物为前列腺素b2、芥酸、油酸、二十二碳六烯酸、5a-孕甾-3，20-二酮、孕二醇、17α，21二羟基孕烯醇酮、石胆酸、17-羟基孕酮、9,10-dhome、皮质酮、脱氧胆酸、8,11,14-二十碳三烯酸、15-脱氧-δ12,14-前列腺素j2、11h-14,15-eeta、维生素d3、8-羟-二十烷四烯酸、11z二十碳烯酸、16(r)-羟-二十烷四烯酸、二十碳二烯酸、12-酮-白三烯b4、硬脂酸、链甾醇、13-l-过氧化氢亚油酸、8(r)-过氧化亚油酸、3-脱氢鞘氨醇、鞘氨醇、熊去氧胆酸、本胆烷醇酮、12,13-dhome、13s羟基十八碳二烯酸、植物鞘氨醇、脂蛋白b4、10e，12z十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、牛磺酸、亚油酸、α-二吗啉酸、9,10-环氧十八碳烯酸、γ-亚麻酸、十六烷二酸、α-亚麻酸、肉豆蔻酸、9-氧代-十八碳二烯酸、19(s)-羟-二十烷四烯酸、二十碳五烯酸、棕榈油酸、二十二碳五烯酸(22n-3)、茉莉酸甲酯、肾上腺素、花生四烯酸、5-酮基二十碳四烯酸、棕榈酸及胆固醇硫酸盐中的一种或任意几种的组合。

17、优选地，所述药物为黄芪桂枝五物汤，其是由以下原料组成：黄芪9g、桂枝9g、芍药9g、生姜18g、大枣4枚。

18、优选地，给药动物胰腺组织生物标志物为前列腺素b2、油酸、8,11,14-二十碳三烯酸、芥酸、8-羟-二十烷四烯酸、11z二十碳烯酸、二十碳二烯酸、8(r)-过氧化亚油酸、12,13-dhome、α-亚麻酸、α-二吗啉酸、9-氧代-十八碳二烯酸、19(s)-羟-二十烷四烯酸、肾上腺素及棕榈酸中的一种或任意几种的组合。

19、优选地，药物调控脂代谢相关通路为不饱和脂肪酸的生物合成、α-亚麻酸代谢、脂肪酸延长、脂肪酸降解、花生四烯酸代谢或脂肪酸生物合成。

20、优选地，药物通过调控不饱和脂肪酸的生物合成、α-亚麻酸代谢改善模型动物胰腺组织脂代谢紊乱。

21、优选地，正常动物与模型动物胰腺组织中代谢物的对比及模型动物胰腺组织生物标志物与给药动物胰腺组织中代谢物的对比均是采用主成分分析、偏最小二乘判别分析及正交-偏最小二乘判别分析进行。分析结果通过vip值来说明变量对模型的贡献度，当某个变量的vip>1时，说明该变量是重要的，可以作为潜在生物标记物。

22、优选地，模型动物胰腺组织生物标志物的筛选是采用火山图分析方法进行。

23、对比现有技术，本发明的有益效果为：

24、本发明提供一种基于脂代谢组学分析评价药物调控代谢途径的方法，利用超高效液相色谱串联高清质谱和多维度数据处理方式，以胰腺组织脂代谢轮廓及脂代谢标记物评价中药调控效应，以胰腺组织脂代谢轮廓宏观表征药物药效的整体特征，以胰腺组织代谢标志物的量变化微观表达药效的精细特征；结合多变量模式识别方法挖掘药物调控糖网病胰腺组织中显著变化的脂代谢标志物，解析与药效生物标志物相关的胰腺组织代谢径路。为中药药效评价、新药筛选和开发提供技术支持。

25、本发明以糖网病小鼠胰腺组织为研究对象，通过多元变量分析建立药效评价模型，并结合模式识别及脂代谢通路分析方法，明确糖网病脂代谢生物标记物及其代谢通路，揭示糖网病的脂代谢在糖网病病理条件下的变化规律，以脂代谢标记物及代谢轮廓为参数，精准评价黄芪桂枝五物汤干预糖网病胰腺组织脂代谢途径的药效作用，阐明黄芪桂枝五物汤对胰腺组织异常脂代谢途径调控作用主要与不饱和脂肪酸的生物合成、α-亚麻酸代谢通路相关，为黄芪桂枝五物汤临床治疗糖网病提供了重要的科学依据。

26、本发明以胰腺组织脂代谢标记物及代谢途径为参数，整个研究过程与药效直接相关联，构建基于靶向调控糖网病胰腺组织脂代谢的药效机制研究模式，突破了传统药物评价方法确认药效的技术瓶颈，解决了现有方法评价药效周期长及效率低下的问题，为创新中药研究提供了新模式。

27、本发明围绕糖网病胰腺组织脂质代谢物变化，利用靶向脂质组学进行作为生物标志物的筛选，具有快速、高通量、高覆盖等优势。