一种电化学发光生物传感器、其制备方法及应用

本技术涉及生物，具体涉及一种电化学发光生物传感器、其制备方法及应用。

背景技术：

1、感染性疾病是一类严重威胁人类健康的疾病，其中，脓毒症等严重感染性疾病已成为发病和死亡的主要原因。测定感染最常用的传统指标有降钙素原、c反应蛋白、白细胞计数、中性粒细胞比、血沉、体温等，但这些指标都不同程度地存在滞后、敏感度低、特异性不高等缺陷。在感染性疾病的预防和治疗过程中，若能及早准确的诊断，即可及早地采取合理的应对措施，进而提高感染性疾病的治疗成功率。

2、肝素结合蛋白(hbp)，又名阳离子抗菌蛋白(cap37)、天青杀素，是一种由成熟中性粒细胞分泌的颗粒蛋白，其为包含222个氨基酸的单链蛋白。发生细菌感染时，部分细菌挥侵入到血管中，细菌本身或细菌释放的毒素刺激成熟中性粒细胞释放hbp，从而导致血液中hbp含量升高。与其它传统指标相比，hbp除具有灵敏度高、特异性强、阳性/阴性检出率高之外，还具有出现早、只在急性细菌感染时浓度极度升高，而在病毒感染和非特异性炎症时保持较低的水平等优点。因此，hbp作为临床新的炎症标志物，具有出现早、特异性强、灵敏度高的特点，在临床应用中具有对病情的早期评估，预后评价，疗效观察等价值，同时可减少抗生素的滥用，减少耐药菌的发生。因此，开发出一种能够快速、特异、敏感、准确地测定肝素结合蛋白的含量的方案，具有重大的临床应用价值和经济意义。

3、目前已被报道的hbp检测方法有酶联免疫法、免疫荧光法、层析法等，然而这些方法灵敏度低，成本高，步骤复杂，所采用的设备昂贵，耗时较长。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明提供一种电化学发光生物传感器、其制备方法及应用，以解决上述现有的hbp检测方法例如酶联免疫法、免疫荧光法、层析法等，灵敏度低，成本高，步骤复杂，所采用的设备昂贵，耗时较长等技术问题。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

3、第一个方面，本发明提供一种电化学发光生物传感器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

4、s1.以镍源、柠檬酸和还原剂为原料进行还原反应，加入铂源继续反应，得到ca@ptni/hns溶液；

5、s2.以对甲苯磺酸溶液、吡咯和金源为原料进行氧化自组装反应，得到au@ppy/tsa纳米复合材料；

6、将au@ppy/tsa纳米复合材料超声分散于g-c3n4分散液中，得到au@ppy/tsa-g-c3n4nfs溶液；

7、用所述au@ppy/tsa-g-c3n4 nfs溶液修饰基底电极，干燥，得到au@ppy/tsa-g-c3n4nfs一次修饰电极；

8、s3.将所述au@ppy/tsa-g-c3n4 nfs一次修饰电极与第一肝素结合蛋白单克隆抗体进行一次共孵育，得到au@ppy/tsa-g-c3n4 nfs-ab1二次修饰电极；

9、将所述二次修饰电极au@ppy/tsa-g-c3n4 nfs-ab1，用肝素结合蛋白溶液修饰电极，得到三次修饰电极，洗涤后，与牛血清白蛋白阻断剂溶液进行二次共孵育，得到四次修饰电极；

10、s4.混合第二肝素结合蛋白单克隆抗体与ca@ptni/hns溶液，反应，纯化后与牛血清白蛋白阻断剂溶液进行二次反应，得到ca@ptni hns-ab2生物偶联物；

11、s5.将所述四次修饰电极置于所述ca@ptni hns-ab2生物偶联物中进行反应，制得所述电化学发光生物传感器。

12、在本技术的一示例性实施例中，步骤s1中，所述镍源与柠檬酸的质量比为1.5-3：1，优选为2-3：1。

13、在本技术的一示例性实施例中，所述还原剂选自硼氢化钠、硼氢化钾和硫代硼氢化钠中的至少一种。

14、在本技术的一示例性实施例中，步骤s1中，所述还原剂与镍源的质量比为1.5-3：1，优选为2-3：1。

15、在本技术的一示例性实施例中，步骤s1中，所述铂源选自氯铂酸、四氯铂酸钾、二(乙酰丙酮)铂和六氯铂酸钠中的至少一种。

16、在本技术的一示例性实施例中，步骤s1中，所述铂源与镍源的质量比为1.5-2：1.5-3，优选为1.5-2：2-3。

17、在本技术的一示例性实施例中，步骤s2中，所述金源选自氯金酸、氯化金、四氯合金酸中的至少一种。

18、在本技术的一示例性实施例中，步骤s2中，所述吡咯与对甲苯磺酸的摩尔比为1-3：10-30，优选为1：10。

19、在本技术的一示例性实施例中，步骤s2中，所述氧化自组装反应的温度为0-5℃，优选为2-5℃；氧化自组装反应的时长为10-24h，优选为12-24h。

20、在本技术的一示例性实施例中，步骤s3中，所述一次共孵育的温度为0-5℃，优选为2-5℃；一次共孵育的时长为6-15h，优选为7-15h。

21、在本技术的一示例性实施例中，步骤s2中，所述金源与吡咯的摩尔比为0.086：1。

22、在本技术的一示例性实施例中，步骤s2中，所述g-c3n4分散液与三维树枝au纳米分散液的体积比为1-3：1-3，优选为1：1。

23、在本技术的一示例性实施例中，步骤s3中，所述二次共孵育的温度为35-40℃，优选为36-40℃二次共孵育的时长为20-40min，优选为25-40min。

24、在本技术的一示例性实施例中，步骤s4中，所述反应的温度为0-5℃，优选为2-5℃；反应的时长为6-15h，优选为7-15h。

25、在本技术的一示例性实施例中，步骤s5中，所述反应的温度为35-40℃，优选为36-40℃；反应的时长为30-60min，优选为40-60min。

26、第二个方面，本发明还提供一种根据如上所述的方法制得的电化学发光生物传感器。

27、第三个方面，本发明还提供一种根据如上所述的方法制得的电化学发光生物传感器在制备肝素结合蛋白含量检测试剂盒中的应用。

28、第四个方面，本发明还提供一种用于检测肝素结合蛋白含量的试剂盒，所述试剂盒包括根据如上所述的方法制得的电化学发光生物传感器。

29、本发明的有益效果：

30、本技术创新地提出以三维树枝au纳米颗粒修饰的g-c3n4复合材料au@ppy/tsa-g-c3n4 nfs为基底发光材料，以k2s2o8作为共反应剂，以ca@ptni hns纳米球作为猝灭剂，构建了一种新型电化学发光传感器，该电化学发光生物传感器能够实现对肝素结合蛋白的定量检测；其中，g-c3n4作为一种新兴ecl发光体，具有发光行为良好，化学稳定性高、制备方法简便、成本低等优点，将其应用于电化学发光生物传感器中，能够提高电化学发光生物传感器的稳定性；掺杂的金纳米颗粒能够加快电子转移速率、增强导电性进而增强g-c3n4的发光信号，进而提高电化学发光生物传感器的灵敏度；通过在对甲苯磺酸(tsa)存在下，吡咯单体被铂源氧化自组装制备au/聚吡咯(au@ppy/tsa)的三维树枝状纳米复合材料，提供了更大的表面积结合捕获抗体及负载更多的金纳米颗粒来增强放大g-c3n4的ecl发光信号号，使得合成的ca@ptni hns纳米球具有猝灭效用的同时还能很好地结合识别抗体，进而提高电化学发光生物传感器的灵敏度和稳定性。

31、本发明通过三维树枝au纳米颗粒提高g-c3n4/s2o82-系统的发光效率，放大信号，而ca@ptni hns纳米球消耗s2o82-达到信号关闭原理构建了高灵敏度的ecl免疫传感器，实现了对肝素结合蛋白的快速、高灵敏度检测。

32、本发明中，通过三维树枝au纳米颗粒修饰的g-c3n4复合材料au@ppy/tsa-g-c3n4nfs基底发光材料与ca@ptni hns纳米球之间的荧光共振量转移原理构建了高灵敏度的ecl免疫传感器，实现了对肝素结合蛋白的快速、高灵敏度检测。

33、本发明采用能量开-关模式，构建了夹心型的电化学发光生物传感器，实现了对肝素结合蛋白的有效检测，该方法操作简单。

34、采用本发明的电化学发光生物传感器对肝素结合蛋白进行检测，稳定性高，重现性好，灵敏度高，线性范围宽，可实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。