一种基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体检测试剂盒的制作方法

本发明属于体外检测，具体涉及一种基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒。

背景技术：

1、伪狂犬病(pseudorabies,pr)是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus,prv)引起的一种能导致母猪繁殖障碍、仔猪出现神经系统紊乱和死亡、成年猪呼吸困难的高度接触性动物传染病，在猪群中常呈暴发性流行，是危害全球养猪业的重大传染病之一。猪是该病目前已知的唯一天然宿主，病猪和带毒猪是其主要传染源。该病是世界动物卫生组织(oie)法定报告动物疫病，是我国的二类动物疫病。研究发现，gb蛋白在prv复制的侵入阶段起着重要作用，它可以帮助细胞膜和病毒囊膜的融合，从而顺利完成病毒侵入，还可以介导感染和未感染细胞之间的膜融合，帮助病毒在细胞间传播，也就是在gb蛋白的调节下，病毒完成与靶细胞接触的第一步，因此缺欠gb蛋白的病毒也就丧失感染能力。同时gb蛋白也是目前许多的检测试剂盒的一个重要包被抗原。尽管与gb蛋白相关的dna疫苗以及多联苗的研制已经非常成功，但是prv在进化中还是形成了多种逃避宿主免疫的机制，猪群难免还会存在prv的感染。因此，检测猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体，评价免疫抗体水平，是猪伪狂犬病毒gb蛋白防控、净化的关键一环。

2、现有的实验室检测猪伪狂犬病病毒gb蛋白抗体的方法主要分为三类：一是传统实验室诊断方法，包括病毒分离鉴定及动物接种实验等；二是免疫学诊断方法，包括病毒中和实验、乳胶凝集实验、酶联免疫吸附实验、琼脂免疫扩散实验、免疫荧光染色技术等检测方法；三是分子生物学方法，包括聚合酶链式反应(rt-pcr)、核酸探针技术等技术。其中elisa是目前使用最为广泛的检测方法，但其缺点在于耗时较长、不能准确定量检测、自动化困难。这些检测方法有的因需要特殊仪器设备操作复杂，有的耗时耗力或不能快速检测病原等，都无法大规模应用于临床样本的快速检测及分析，因此建立一种能准确定量、高敏感性、全自动化、快速检测猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体的方法很有必要。

3、化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，clia)技术是将化学发光体系和免疫学方法结合起来的一种诊断技术，通过将免疫信号放大转化为化学发光信号，检测发光强度从而检测相应物质的含量。作为一种高灵敏度、高通量、高自动化、宽检测线的新型的化学发光免疫分析检测方法，已经在人类病原及抗体检测中得到广泛应用，在动物疫病检测领域也已经开始发挥其积极作用。虽然此方法已经用于人医乙肝三项、肿瘤标志物等的检测，兽医上也开始使用此方法检测口蹄疫o、a、asia 1型抗体等，但是由于检测对象的不同，使用抗原、抗体等关键原料不同，其检测体系并不能通用，检测效果相差很大。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，不仅能定量检测猪血清中猪伪狂犬病毒gb蛋白的特异性抗体，而且能实现自动化、高敏感性、高重复性检测的目的。

2、本发明提供了一种基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，包括磁微粒混悬液、稀释液和酶标二抗；

3、所述磁微粒混悬液中混悬有磁微粒偶联的gbb蛋白；

4、所述gbb蛋白的氨基酸序列如seq id no:5所示。

5、优选的，所述磁微粒的粒径包括0.5～3μm。

6、优选的，所述磁微粒的表面官能团包括以下至少一种：羧基、甲苯磺酰基和链霉亲和素。

7、优选的，所述磁微粒包括以fe3o4为核心的磁性微粒。

8、优选的，所述磁微粒偶联的gbb蛋白中每毫克磁微粒中偶联10～100μg的gbb蛋白。

9、优选的，所述稀释液为0.1m ph 7的mops缓冲液；所述mops缓冲液为含有质量百分含量5％的bsa、0.5％的tween-20、0.05％的proclin300、0.5m的mgcl2、3％的水解乳蛋白和1％的peg6000的水溶液。

10、优选的，还包括以下至少一项：样本稀释液、校准品、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。

11、优选的，所述样本稀释液为含有质量百分含量5％bsa、质量百分含量1％葡萄糖的0.1m ph 7.0的pbs。

12、优选的，所述浓缩洗涤液为含有体积百分含量0.5％的tween-20的ph 7的pbs缓冲液或者0.05m ph8的tris缓冲液。

13、优选的，所述标准品为将高效价的猪伪狂犬病毒gb抗体血清利用所述样本稀释液稀释至梯度浓度，得到抗体为0u、10u、40u、160u、640u、2560u的血清；

14、所述高效价的猪伪狂犬病毒gb抗体血清是指gb抗体效价大于1:5000的抗体血清；

15、10u的血清定义为将gb抗体效价为1:5000的猪伪狂犬病毒gb抗体血清稀释2048倍得到的抗体血清。

16、本发明提供了一种基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，包括磁微粒混悬液、稀释液和酶标二抗；所述磁微粒混悬液中混悬有磁微粒偶联的gbb蛋白；所述gbb蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。本发明通过重组表达，将获得的gbb蛋白与磁微粒偶联，制备得到磁微粒混悬液。本发明基于间接法检测猪伪狂犬病毒抗体，首先磁微粒混悬液通过gbb蛋白与血清中抗gb蛋白抗体发生特异性结合，形成的二元复合物再与酶标二抗结合，形成gbb蛋白-抗gb蛋白抗体-酶标二抗三元复合物，利用磁场力分离，再利用酶的降解特定底物产生光信号，得到血清中信号强度，再根据标准曲线，实现定量检测猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体含量的目的。本发明提供的试剂盒基于管式化学发光免疫检测技术，具有高灵敏度、高通量、高自动化、宽检测线的特点，能够实现准确定量、高敏感性、高通量、自动化检测的目的，具有重大意义。

17、进一步的，本发明提供的试剂盒，具体限定了磁微粒混悬液中磁微粒粒径，磁微粒表面修饰的官能团种类以及gbb蛋白的偶联量。实验表明，粒径0.5～3μm，表面修饰羧基、甲苯磺酰基和链霉亲和素的磁珠均能够实现管式化学发光的检测，但优化筛选结果表明，3μm的羧基磁珠检测结果最佳。

技术特征：

1.一种基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，包括磁微粒混悬液、稀释液和酶标二抗；

2.根据权利要求1所述基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的粒径包括0.5～3μm。

3.根据权利要求1所述基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的表面官能团包括以下至少一种：羧基、甲苯磺酰基和链霉亲和素。

4.根据权利要求1所述基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒包括以fe3o4为核心的磁性微粒。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒偶联的gbb蛋白中每毫克磁微粒中偶联10～100μg的gbb蛋白。

6.根据权利要求1所述基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液为0.1m ph 7的mops缓冲液；所述mops缓冲液为含有质量百分含量5％的bsa、0.5％的tween-20、0.05％的proclin300、0.5m的mgcl2、3％的水解乳蛋白和1％的peg6000的水溶液。

7.根据权利要求1～4和6中任意一项所述基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括以下至少一项：样本稀释液、校准品、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。

8.根据权利要求7所述基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为含有质量百分含量5％bsa、质量百分含量1％葡萄糖的0.1m ph 7.0的pbs。

9.根据权利要求7所述基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含有体积百分含量0.5％的tween-20的ph 7的pbs缓冲液或者0.05m ph8的tris缓冲液。

10.根据权利要求7所述基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gb蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标准品为将高效价的猪伪狂犬病毒gb抗体血清利用所述样本稀释液稀释至梯度浓度，得到抗体为0u、10u、40u、160u、640u、2560u的血清；

技术总结本发明提供了一种基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体检测试剂盒，属于体外检测技术领域。一种基于管式化学发光技术的猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体检测试剂盒，包括磁微粒混悬液、稀释液和酶标二抗；所述磁微粒混悬液中混悬有磁微粒偶联的gBb蛋白；所述gBb蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。本发明所述试剂盒通过定量检测猪血清中猪伪狂犬病毒gB蛋白的特异性抗体实现猪伪狂犬病毒的检测，并实现自动化、高敏感性、高重复性检测目的。技术研发人员：林密,包艳芳,潘晓乐,李涛善,蒋韬,左宜理,许福玲,许辉,李昕,杨光受保护的技术使用者：兰州兽研生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/7/25