一种筛选高细胞免疫应答能力奶牛的方法及应用

本发明属于动物生产领域，具体涉及到一种筛选高细胞免疫应答能力奶牛的方法及应用。

背景技术：

1、通过抗病育种提升奶牛综合抗病能力，是改善奶牛健康、降低疾病发生的重要途径。传统的单一疾病抗性选择和健康性状选择周期长、进展小，并且存在生产性能降低和“一病消、多病长”的风险。因此挖掘能够反映奶牛综合抗病能力，并且易于测定应用的抗病性状或标志是奶牛育种中迫切需要解决的重大科学问题。

2、畜禽免疫学相关研究和新技术的发展，为解决上述问题提供了新思路。动物的抗病性能主要依赖于自身的免疫系统，适应性免疫应答作为机体“最后一道防线”，具有高效性、特异性和记忆性，最终决定着动物患病与否。细胞免疫作为适应性免疫的重要组成部分，在奶牛的常见各类炎症疾病中发挥重要作用。最新的研究表明，机体外周血中维持适应性免疫平衡，并介导细胞免疫应答的t细胞亚群分布受遗传影响很大，具有成为反映奶牛综合抗病性状或标志的巨大潜力。然而受限于畜禽免疫试剂和方法，目前无法对奶牛外周血中各t细胞亚群进行全面、系统、准确地表型鉴定和功能分析，且t细胞亚群类型众多，不同的细胞亚群在不同的病原体入侵机体时发挥的主次作用不同，尚无法确定某一个细胞亚群代表适应性免疫的综合水平，因此尚未鉴定出精准、高效的奶牛综合抗病性标志。现有的替代性方法是利用免疫学经典的迟发型超敏反应测定细胞免疫应答性状，这些方法已经在鸡、猪和牛上得到验证，应用该性状选择出来的高免疫应答性状种公牛，其女儿的乳腺炎、子宫内膜炎、蹄病等常见病发病率显著下降，且初乳质量明显提高，生产性能未受影响。但是这些检测方法需要对牛进行保定，过程繁琐，工作量大，且因测定过程以人工测量为主，存在一定误差。导致目前仅在极少的经济价值高的种公牛选择上应用，无法广泛应用于其他种公牛和后备母牛。

3、来自猪、奶牛等的免疫遗传学相关研究表明，细胞介导的免疫应答具有数量性状特征，遗传力达到0.30％。现代医学的大量实践表明，针对念珠菌素的迟发型超敏反应检测是判定细胞介导的免疫应答功能的有效方法。但是上述方法如果在奶牛等大型家畜上应用十分困难，尤其是为了检测动物的迟发型超敏反应需要对动物进行保定，并且需要对其免疫前后皮肤褶皱厚度进行测量，这些操作繁琐且人工测量误差较大，不宜于大规模推广。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种筛选高细胞免疫应答能力奶牛的方法。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：采集奶牛初始血样；

5、将奶牛初始血样无菌培养，加入红细胞裂解液室温静置后离心弃上清，重复上述操作至无红细胞为止，得到无红细胞的血样；

6、使用牛血清白蛋白溶液(0.5％bsa)稀释异硫氰酸荧光素标记的wc1抗体(anti-wc1-fitc)，藻红蛋白偶联物复合荧光素标记cd3抗体(anti-cd3-percp-cyanine5.5)，藻红蛋白荧光素标记的cd8抗体(anti-cd8-pe)和别藻青蛋白荧光素标记的cd4抗体(anti-cd4-apc)，配制合并染料稀释液，将合并染料稀释液加到无红细胞的血样中，室温避光孵育后补加bsa，离心弃上清后加pfa固定液，过滤到流式管中，用流式细胞仪检测各t细胞亚群；

7、在奶牛的淋巴细胞中分别选择wc1+cd3-和wc1-cd3+t细胞群，wc1-cd3+t细胞中同时选择cd4+和cd8+的cd4+cd8+dp t细胞群；wc1+cd3-t细胞群的绝对数量和在淋巴细胞中的百分比作为细胞免疫指数，cd4+cd8+dp t细胞群的绝对数量和在wc1-cd3+t细胞群中的百分比作为细胞免疫指数；

8、采集初始血样后，当天对奶牛进行肌肉注射模式抗原混合物；第14天再次对奶牛进行肌肉注射模式抗原混合物；第21天采集奶牛最终血样；测定最终血样的细胞免疫指数；计算注射模式抗原后细胞免疫指数增量，计算方法为，最终血样的细胞免疫指数减去与之对应的初始血样细胞免疫指数；

9、作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述采集奶牛血样，其中奶牛为经牧场兽医检查判定处于健康状态，无任何疾病的奶牛，血样为奶牛的edta抗凝血。

10、作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述加入红细胞裂解液室温静置，其中，奶牛血样与红细胞裂解液的质量比为2:3，静置时间为5min。

11、作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述加入红细胞裂解液室温静置后离心弃上清，离心转速为1600rpm/min，时间为5min。

12、作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述使用bsa稀释anti-wc1-fitc,anti-cd3-percp-cyanine5.5,anti-cd8-pe和anti-cd4-apc，其中bsa质量分数为0.5％，稀释比例为anti-cd3-percp-cyanine5.5:1:300，anti-wc1-fitc:1:200，anti-cd8-pe:1:300，anti-cd4-apc:1:400。

13、作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述将合并染料稀释液加到无红细胞的血样中，其中，合并染料稀释液与无红细胞的血样的质量比为1:2。

14、作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述室温避光孵育后补加bsa，离心弃上清后加pfa固定液，其中，避光孵育时间为20min，补加bsa的质量分数为0.5％，离心转速为1600rpm/min，时间为5min，pfa固定液质量分数为0.5％，补加bsa与pfa固定液的质量比为3:4。

15、作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述模式抗原混合物为在磷酸缓冲溶液中按照2:1的比例加入灭活白色念珠菌和quila佐剂，并调整浓度至0.25mg/ml。

16、作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述灭活白色念珠菌，其中，白色念珠菌标准菌株在88℃条件下水浴加热1h。

17、作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述当天对奶牛进行肌肉注射模式抗原混合物和第14天再次对奶牛进行肌肉注射模式抗原混合物，其中当天与第14天注射模式抗原混合物的质量比为1:1。

18、本发明有益效果：

19、(1)细胞介导的免疫应答过程中t细胞发挥着重要的作用，因此本发明首次系统研究了奶牛针对模式抗原(灭活白色念珠菌)的t细胞免疫应答，对奶牛的33个t细胞亚群累计216个指标进行了检测，并对其进行了动力学分析，分析结果确定了9个t细胞亚群参与奶牛针对模式抗原(灭活白色念珠菌)的免疫应答，通过与传统迟发型超敏反应表型的相关分析，最终精准锁定wc1+cd3-γδt细胞群和cd4+cd8+dp t细胞群2个为细胞介导的免疫应答生物标志物。

20、(2)本发明操作简单，仅需2次采血、2次抗原注射、2次检测，1个月内即可准确地在奶牛群中筛选出高细胞免疫应答能力的奶牛，牧场管理人员可以明确得知高细胞免疫应答能力的奶牛，并将筛选后的奶牛作为后备母牛进行人工授精。

21、(3)本发明对待测奶牛伤害非常小，采集的血样仅需一滴(200μl)即可，且模式抗原经过长期大量的验证对奶牛健康和乳品质无任何影响。本发明的检测成本低廉，经过测算本发明所述的一种筛选高细胞免疫应答能力牛的方法在实验室应用阶段仅需20元，将来产业化应用后，成本还可进一步降低。

22、(4)本发明检测精度高，采用流式细胞仪对血液细胞中特定细胞亚群的数量进行检测，最大程度上排除了人工检测造成的误差，同时检测效率显著提升，传统方法由于需要对牛进行保定，检测一头牛一个指标需要耗时半天以上，本发明所述的一种筛选高细胞免疫应答能力牛的方法中免疫指数的测定，一名实验人员一天可完成200头牛以上的样本量检测。本发明所述的一种筛选高细胞免疫应答能力牛的方法在中国荷斯坦牛的育种实践中表现出了显著的效果，所确定的免疫指数遗传力可达0.49-0.51，高免疫应答奶牛群体的乳腺炎和消化道疾病等奶牛常见病发病率下降50％以上，其体细胞数显著降低了20％以上，且高免牛305天产奶量提高10％以上。