用于检测FOXC1、DCLK1、CD8和AR蛋白的多重免疫荧光染色方法及试剂盒与流程

本发明属于多重免疫荧光，特别涉及用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的多重免疫荧光染色方法及试剂盒。

背景技术：

1、三阴性乳腺癌(tr ip le-negat ive breast cancers，tnbc)是指缺乏雌激素受体(estrogen receptor，er)、孕激素受体(progesterone receptor，pr)和人类表皮生长因子受体(human epiderma l growth factor receptor 2，her2)表达的一类乳腺癌，其占所有新发乳腺癌的比例为10％～20％。和其它分型的乳腺癌相比，tnbc因其缺乏有效的治疗靶点而具有高侵袭性、高转移风险和较差的临床预后等特点。目前，主要的治疗手段仍以化疗为主，患者的生存受益相对有限。

2、肿瘤精准检测是一项利用基因组学、表观遗传组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等多组学技术的检测方法，旨在更全面地了解肿瘤的生物学信息，以制定个性化的治疗方案。精准检测对于tnbc的精准治疗具有重要价值。近年来的研究表明，tnbc在病理特征、生物学和基因表达水平上具有高度异质性，可以根据不同的基因特征将其分为不同的分子亚型。目前，被广泛接受的分型系统包括lehmann六分型、burstein四分型和"复旦分型"。其中，"复旦分型"系统具有多组学融合的特点，并且经过future系列研究证实，基于"复旦分型"的精准治疗显著改善了tnbc患者的生存状况。

3、“复旦分型”标准将tnbc分为4个不同的亚型，分别是基底样免疫抑制型(basa l-likeimmune-suppressed，blis)、免疫调节型(immunomodu l atory，im)、腔面雄激素受体型(l umina l androgen receptor，lar)和间充质样型((mesenchyma l，mes)。每个亚型都具有特异的基因组和转录组改变，并有相应的特异性治疗策略。临床应用中，可以根据4个亚型特异性标志物(foxc1、dclk1、cd8和ar)的免疫组织化学(immunoh i stochemi stry，ihc)染色结果准确区分“复旦分型”的各个亚型，实现从多组学大数据分析到临床应用的转化。经过大量的实验证实，i hc检测结果与患者基因检测结果高度一致，保证了检测的精确性，而且i hc检测耗时相对较短，具有广泛的可推广性。

4、i hc方法虽然操作相对简便，但该技术也存在一些局限性。首先，每张组织切片只能标记一个标志物，因此对于需要检测多个标志物的样本，需要制备多张切片，可能导致切片不足的问题，特别是在小肿瘤样本、活检组织或珍稀样本。此外，由于每个标志物需要单独的切片，样本切片的利用率相对较低。最后，i hc结果可能受不同观察者之间的变异性影响，从而引入潜在的判读误差。而多重免疫荧光(mu lt ip lexed immunoh i stochemistry，mi hc)技术克服了i hc技术上述的局限性，该技术允许在同一张切片上检测多个蛋白质靶标，同时展示包括细胞组成、功能、细胞间相互作用、组织细胞原位空间构成和分布等信息，此外，mi hc技术可以使检测信号得到10-100倍增强，提高了检测的灵敏度，减少了假阴性的出现。借助halo数字病理图像分析平台可以很方便、快速地对目标蛋白进行定性和定量的分析，从而提高病理检测的精确度，并避免人工判读带来的误差，是i hc检测很有前景的替代方法，mi hc技术已在国内外研究中得到广泛的应用。

5、目前临床上尚没有公认的tnbc mi hc分型方案，因此，亟需一种可用于临床检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的mi hc染色方法，能够简便、高效、准确的进行tnbc分子分型，提示其基因组特点以及个体化的治疗策略。

技术实现思路

1、为了解决临床上缺乏用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的mi hc方法的问题，本发明提供了用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的多重免疫荧光染色方法，该染色方法有利于更加简便、高效、准确的检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白，辅助进行三阴性乳腺癌的分型，进而获得更准确的个体化治疗策略。

2、本发明还提供了用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的多重免疫荧光染色试剂盒。

3、本发明通过以下技术方案实现：

4、本发明提供用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的多重免疫荧光染色方法，所述染色方法包括：

5、配制foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的一抗工作液和染料工作液；

6、将待染色样片、所述一抗工作液、所述染料工作液、二抗试剂、抗原修复液、过氧化物酶封闭剂和清洗液放入染色机的相应位置，运行染色程序，按照foxc1、dclk1、cd8和ar的顺序依次对4种蛋白进行逐一染色，获得染色样片；

7、以防荧光淬灭封片剂对所述染色样片进行复染并封片，获得待测样片。

8、可选的，所述待染色样片通过以下方法制备：

9、将待测样本以3-5μm厚度切片，后置于65-72℃环境下烘烤1-1.5h，获得待染色样片。

10、进一步的，所述配制foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的一抗工作液和染料工作液，具体包括：

11、分别将foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的一抗用抗体稀释液进行稀释，获得一抗工作液；

12、分别将foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的荧光染料用信号放大液进行稀释，获得染料工作液。

13、进一步的，foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的一抗分别为兔抗人foxc1单克隆抗体、兔抗人dclk1单克隆抗体、兔抗人cd8单克隆抗体和兔抗人ar单克隆抗体；

14、foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白对应的荧光染料分别为tsa520、tsa570、tsa480和tsa620。

15、进一步的，所述二抗试剂包括增强剂和多聚hrp；

16、所述抗原修复液包括ph9.0的tr i s-edta缓冲液；

17、所述过氧化物酶封闭剂包括质量分数为0.3％的过氧化氢溶液；

18、所述清洗液通过以下方法制备：

19、在pbs中加入0.05％的吐温-20，获得清洗液(即pbst)。

20、进一步的，所述将待染色样片、所述一抗工作液、所述染料工作液、二抗试剂、抗原修复液、过氧化物酶封闭剂和清洗液放入染色机的相应位置，运行染色程序，按照foxc1、dclk1、cd8和ar的顺序依次对4种蛋白进行逐一染色，获得染色样片，具体包括：

21、将待染色样片、所述一抗工作液、所述染料工作液、二抗试剂、抗原修复液、过氧化物酶封闭剂和清洗液放入染色机的相应位置，运行染色程序：

22、对foxc1蛋白进行染色，染色程序依次包括：

23、脱蜡、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗试剂孵育、荧光染料孵育、高温洗脱；

24、按照dclk1、cd8和ar的顺序依次对3种蛋白进行逐一染色，获得染色样片，其中，每一种蛋白的染色程序均依次包括：

25、封闭、一抗孵育、二抗试剂孵育、荧光染料孵育、高温洗脱。

26、进一步的，所述二抗试剂包括增强剂和多聚hrp；

27、所述脱蜡包括：脱蜡液脱蜡30min，无水乙醇冲洗4次，pbst冲洗4次；

28、所述抗原修复包括：抗原修复液99℃修复30min，pbst冲洗9min；

29、所述封闭包括：过氧化物酶封闭剂35℃避光孵育6min，pbst冲洗9min；

30、所述一抗孵育包括：一抗工作液35℃孵育60min，pbst冲洗9min；

31、所述二抗试剂孵育包括：增强剂35℃孵育15min；pbst冲洗9min；

32、多聚hrp35℃孵育20min，pbst冲洗9min；

33、所述荧光染料孵育包括：荧光染料工作液35℃孵育10min，pbst冲洗9min；

34、所述高温洗脱包括：抗原修复液99℃洗脱8min，pbst冲洗9min。

35、进一步的，所述以防荧光淬灭封片剂对所述染色样片进行复染并封片，获得待测样片，具体包括：

36、将所述染色样片进行冲洗、晾干，后以防荧光淬灭封片剂进行复染，并用盖玻片封片，获得待测样片。

37、基于同一发明构思，本发明提供用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的多重免疫荧光染色试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：

38、抗原修复液、过氧化氢、抗体稀释液、抗foxc1单克隆抗体、抗dclk1单克隆抗体、抗cd8单克隆抗体、抗ar单克隆抗体、二抗试剂、tsa480、tsa520、tsa570、tsa620、信号放大液、防荧光淬灭封片剂。

39、进一步的，所述抗原修复液包括ph9.0的tr i s-edta缓冲液；

40、所述抗foxc1单克隆抗体、所述抗dclk1单克隆抗体、所述抗cd8单克隆抗体和所述抗ar单克隆抗体分别为兔抗人foxc1单克隆抗体、兔抗人dclk1单克隆抗体、兔抗人cd8单克隆抗体和兔抗人ar单克隆抗体；

41、所述二抗试剂包括增强剂和多聚hrp。

42、基于同一发明构思，本发明提供用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的多重免疫荧光检测方法，所述检测方法包括：

43、配制foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的一抗工作液和染料工作液；

44、将待染色样片、所述一抗工作液、所述染料工作液、二抗试剂、抗原修复液、过氧化物酶封闭剂和清洗液放入染色机的相应位置，运行染色程序，按照foxc1、dclk1、cd8和ar的顺序依次对4种蛋白进行逐一染色，获得染色样片；

45、以防荧光淬灭封片剂对所述染色样片进行复染并封片，获得待测样片；

46、所述待测样片用数字病理切片扫描仪进行成像，成像所得图像用halo数字病理图像分析软件进行分析，获得foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的分析数据。

47、基于同一发明构思，本发明还提供foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的检测方法，所述检测方法包括：

48、将待染色样片、一抗工作液、染料工作液、二抗试剂、抗原修复液、过氧化物酶封闭剂和清洗液放入染色机的相应位置，运行染色程序，按照foxc1、dclk1、cd8和ar的顺序依次对4种蛋白进行逐一染色，获得染色样片；

49、以防荧光淬灭封片剂对所述染色样片进行复染并封片，获得待测样片；

50、所述待测样片用数字病理切片扫描仪进行成像，成像所得图像用halo数字病理图像分析软件进行分析，获得foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的分析数据；

51、其中，所述一抗工作液、所述染料工作液、所述二抗试剂、所述抗原修复液、所述过氧化物酶封闭剂、所述防荧光淬灭封片剂的制备原料均取自上述用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的多重免疫荧光染色试剂盒。

52、本发明中，抗体稀释液、抗foxc1单克隆抗体、抗dclk1单克隆抗体、抗cd8单克隆抗体、抗ar单克隆抗体、二抗试剂、tsa480、tsa520、tsa570、tsa620、信号放大液、防荧光淬灭封片剂和脱蜡液均采用市售产品，在此不再对其成分和/或浓度做特别限定。

53、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

54、1.本发明用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的多重免疫荧光染色方法，该方法通过选取合适的试剂及合理的染色程序，实现了待测样本foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的mihc染色，可用于mi hc检测，填补了mi hc检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白技术的空白，采用mi hc技术对foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白进行检测，可在一张切片上同时展示4种蛋白的表达情况，与现有基于i hc技术的foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白检测方法相比，本发明减少了样本的使用量，提高了乳腺癌样本切片的利用率。

55、2.本发明用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的多重免疫荧光染色方法，该方法可以在同一张切片上对tnbc四个亚型的特异性标志物foxc1、dclk1、cd8和ar进行染色，染色后的样片可利用数字病理切片扫描仪进行成像，成像所得图像用halo数字病理图像分析软件对foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白进行定性和定量分析，简化了检测和分析的流程，提高了检测的效率和精确度，可以更准确地识别“复旦分型”的各个亚型，有助于医生更好地了解每位患者的肿瘤特点，制定个性化的治疗方案，从而提高治疗效果，此外，mi hc技术可以使检测信号得到10-100倍增强，提高了检测的灵敏度，减少了假阴性的出现，避免人工判读带来的误差，具备广泛的应用前景。

56、3.本发明用于检测foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的多重免疫荧光染色试剂盒，该试剂盒中的试剂可用于乳腺癌样本foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的mi hc染色和mi hc检测，实现了foxc1、dclk1、cd8和ar蛋白的自动化检测，提高了样本的利用率，能够更加简便、高效、准确的对tnbc分型，帮助医生为三阴性乳腺癌患者制定个性化的治疗方案。