一种用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法

本发明属于荧光纳米生物，尤其涉及一种用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法。

背景技术：

1、在过去的几十年里，细菌感染被认为是世界各地公共卫生中面临的最大挑战之一，快速检测细菌感染并对其进行治疗至关重要。细菌感染通常包括蜂窝织炎、脓肿以及术后感染，在细菌感染中最常见的细菌主要是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。大肠杆菌(e.coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)无处不在，有时可能会导致各种并发症和慢性感染，严重的可能会诱发败血症、肺炎、脑膜炎等疾病。因此，实现细菌病原体感染的快速检测和诊断治疗迫在眉睫。

2、传统的细菌识别方法往往耗时且灵敏度有限。随着纳米技术的发展，将纳米材料与细菌识别相结合，为细菌的快速、准确识别提供了新的途径。特别是利用适配体等生物识别分子与纳米簇的结合，可以实现对特定细菌的高灵敏度和高特异性识别。这种技术的出现，不仅提高了细菌识别的效率，还为后续的杀菌治疗提供了精准的目标。

3、近年来，纳米簇作为一种新兴的纳米材料，在生物医学、光电子学等领域展现出独特的优势。特别是聚集诱导发光(aie)的铜纳米簇(cu ncs)，由于其出色的光学性能和生物相容性，成为研究的热点。aie纳米簇在聚集状态下表现出强烈的荧光发射，这一特性使得它们在生物标记、生物成像和传感等方面具有巨大的应用潜力。除了作为识别工具外，纳米簇本身还具有杀菌作用。研究表明，某些纳米簇可以通过破坏细菌的细胞壁或抑制细菌的生长代谢来杀灭细菌。将抗生素与纳米簇相结合，可以进一步增强其杀菌效果。这种协同作用不仅可以实现对细菌的高效杀灭，还可以减少抗生素的使用量，降低耐药性的风险。鉴于此，亟需提出一种可同时实现细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感技术。

技术实现思路

1、为实现上述目的，本发明提供了一种用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，旨在实现对细菌的高效识别、捕获和杀菌。包括：

2、制备aie cuncs溶液，并对所述aie cuncs溶液进行多粘菌素e修饰，获得多粘菌素e修饰后的aie cuncs；

3、培养细菌，并制备适配体功能化的磁珠；

4、将标记有大肠杆菌适配体的链霉亲和素化的磁珠连结pme@aie cu ncs识别并捕获大肠杆菌，获得imb@apt-e/e.coli/pme@aie cuncs三明治结构；

5、通过紫外灯照射使适配体中的光控基团pc-linker断裂，磁性分离后取上清液，采用荧光光谱仪测荧光强度，实现对细菌的识别捕获。

6、优选地，所述制备aie cuncs溶液的过程包括：

7、在室温磁力搅拌下，将无水cuso4溶液加入到2.4ml超纯水中，充分混匀后，再添加gsh溶液；

8、转移至37℃水浴条件下磁力搅拌30min，随后用1m的naoh溶液将体系的ph调至4.0～5.5；

9、将反应溶液在37℃条件下剧烈搅拌1h，制备获得cuncs溶液；

10、将ce(no3)3·6h2o溶液加入到所述cuncs溶液，定容后于室温条件下搅拌10min；

11、再用mw＝500da的透析袋透析1h，制得所述aie cuncs溶液。

12、优选地，所述无水cuso4溶液和gsh溶液的摩尔比为8:1；

13、所述ph的范围为4.6～4.7；

14、所述ce(no3)3·6h2o溶液的用量为20mm的溶液50μl。

15、优选地，对所述aie cuncs溶液进行多粘菌素e修饰，获得多粘菌素e修饰后的aiecuncs的过程包括：

16、在cuncs中加入多粘菌素e和硝酸铈溶液，用水定容至8ml后进行磁力搅拌，制得多粘菌素e修饰的aie cuncs。

17、优选地，所述cuncs的用量为1.6ml；

18、所述多粘菌素e的用量为2.4ml4mg/ml，用水定容至8ml后，剧烈搅拌1h。

19、优选地，所述培养细菌的过程包括：

20、将细菌菌落置于10ml lb液体培养基中，随后将细菌置于37℃的恒温振荡器中，以180rpm的速度培养过夜。

21、优选地，所述细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌。

22、优选地，制备适配体功能化的磁珠的过程包括：

23、将生物素和光控基团pc-linker标记的大肠杆菌适配体apt-e与链霉亲和素标记的磁珠在27℃下反应1h，随后，用pbs缓冲溶液洗两次后，进行磁性分离，制得适配体功能化的磁珠imb@apt-e。

24、优选地，将标记有大肠杆菌适配体的链霉亲和素化的磁珠连结pme@aie cuncs识别并捕获大肠杆菌，获得imb@apt-e/e.coli/pme@aie cuncs三明治结构的过程包括：

25、将磁珠imb@apt-e与不同浓度的细菌液混匀，并用1×pbs定容至1ml，振荡孵育，磁性分离以后用tri-hcl清洗2次，弃去上清液以洗去游离的细菌液；

26、向溶液中分别加入多粘菌素e修饰的aie cuncs，在27℃条件下振荡孵育15h形成imb@apt-e/e.coli/pme@aie cuncs三明治结构。

27、优选地，所述细菌液的浓度为：108～102cfu/ml；

28、所述振荡孵育的温度和时间分别对应为27℃、1h；

29、所述tri-hcl缓冲含有nacl和mgcl2且ph＝7.20；

30、所述紫外灯为365nm的紫外灯，照射时间为4min。

31、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

32、本发明的适配体荧光传感方法制备了pme@aie cu ncs纳米材料，该材料具有优异的发光性能和稳定性。通过该材料与imb@apt-e的相互作用并识别捕获大肠杆菌，在免疫磁珠、目标细菌和抗生素修饰的金属纳米簇之间形成了一种imb@apt-e/e.coli/pme@aie cuncs的“三明治夹心结构”，构建获得的了可以高效识别细菌的生物传感器，可以用于细菌的识别、捕获和抗菌一体化的研究。当磁性分离后，细菌和抗生素修饰的金属纳米簇共同作用一段时间以后，部分细菌在金属纳米簇和抗生素的协同作用下被杀死，本发明提出的适配体荧光传感技术，通过构建“三明治夹心结构”实现细菌识别、捕获与杀菌一体化，提高了抗菌效率，降低了耐药性风险，为细菌感染治疗提供了新策略。

33、本发明中制备的金属纳米簇具有抗菌性能，“三明治结构”的体外抗菌研究表明，金属纳米簇协同抗生素对e.coli的抗菌率为91.0％。

技术特征：

1.一种用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，其特征在于，所述制备aie cuncs溶液的过程包括：

3.根据权利要求2所述的用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，其特征在于，对所述aie cuncs溶液进行多粘菌素e修饰，获得多粘菌素e修饰后的aie cu ncs的过程包括：

5.根据权利要求4所述的用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，其特征在于，所述cuncs的用量为1.6ml；

6.根据权利要求1所述的用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，其特征在于，所述培养细菌的过程包括：

7.根据权利要求6所述的用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，其特征在于，所述细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌。

8.根据权利要求1所述的用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，其特征在于，制备适配体功能化的磁珠的过程包括：

9.根据权利要求1所述的用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，其特征在于，将标记有大肠杆菌适配体的链霉亲和素化的磁珠连结pme@aie cu ncs识别并捕获大肠杆菌，获得imb@apt-e/e.coli/pme@aie cuncs三明治结构的过程包括：

10.根据权利要求9所述的用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，其特征在于，

技术总结本发明公开了一种用于细菌识别、捕获与杀菌的适配体荧光传感方法，包括：制备AIE CuNCs溶液，并对AIE CuNCs溶液进行多粘菌素E修饰，获得多粘菌素E(PME)修饰后的AIE CuNCs；培养细菌，并制备适配体功能化的磁珠；将标记有大肠杆菌适配体的链霉亲和素化的磁珠连结PME@AIE Cu NCs识别并捕获大肠杆菌，获得IMB@Apt‑E/E.coli/PME@AIE CuNCs三明治结构；通过紫外灯照射使适配体中的光控基团PC‑linker断裂，磁性分离后取上清液，采用荧光光谱仪测荧光强度，实现对细菌的识别捕获。本发明提高了细菌检测的灵敏度和选择性，实现了对细菌的即时杀灭。技术研发人员：高中锋,张赛美,李延雷,杨晓晨,孙梦雪,董江雪受保护的技术使用者：济南大学技术研发日：技术公布日：2024/7/25