一种适用于枸杞叶片的石蜡切片方法

本发明属于石蜡切片，具体涉及一种适用于枸杞叶片的石蜡切片方法。

背景技术：

1、枸杞属茄科枸杞属落叶灌木，其干果产量高、品质好、农残低、药用成分多糖含量高，可药食同源。宁夏枸杞具有较高的生态价值，常被用于水土保持和造林绿化。枸杞叶片直接暴露在外界环境中，对外界环境变化极其敏感，其结构特征能够反映植物对水分的利用情况。

2、石蜡切片技术是研究植物细胞组织形态变化的常用技术。柔软植物叶片含水量较高，结构脆弱，在进行制片时细胞结构易变形不完整。坚硬植物叶片结构紧密，不易于浸蜡。不同植物叶片不同发育及柔软程度差异较大，枸杞叶主脉较脆弱，与枸杞叶其他部分柔软程度不同。因此，枸杞叶具体的脱水、透明、浸蜡时间与浓度需具体确定，避免处理过度，浸蜡不足等问题。目前枸杞石蜡切片普遍存在的缺点如下：

3、(1)脱水与透明时间过长，破坏了植物组织细胞形态及其结构，组织收缩；

4、(2)浸蜡时间太短，浸蜡程度未达到；

5、(3)水作为粘片剂，蜡带在载玻片上极易脱落；

6、(4)烤片温度过高，导致石蜡过早融化，不易脱蜡且组织细胞形态结构未达到固定效果，发生变形；

7、(5)脱蜡时间过久，破坏了植物组织细胞形态及其结构。

技术实现思路

1、基于上述问题，本发明对传统石蜡切片技术进行改进，建立枸杞叶细胞结构完整的石蜡切片制作方法。

2、本发明的目的是提供枸一种适用于枸杞叶片的石蜡切片方法，其包括以下步骤：

3、(1)取材：将枸杞叶洗净；

4、(2)固定：向枸杞叶加入材料体积15～20倍的faa固定液，置于室温；

5、(3)脱水：将固定后的材料依次放入体积百分浓度75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇(ⅰ)、95％乙醇(ⅱ)、无水乙醇(ⅰ)、无水乙醇(ⅱ)，各1-1.2h；

6、(4)透明：将脱水后的材料依次放入无水乙醇和二甲苯按体积比1:1混合液、无水乙醇和二甲苯按体积比1:4混合液、纯二甲苯(ⅰ)、纯二甲苯(ⅱ)，各1-1.2h；

7、(5)浸蜡与包埋：向透明后的材料加入二甲苯和石蜡液按体积比1:1混合物中40℃过夜处理，转入100％石蜡液中59-60℃处理1-1.2h，再换入100％石蜡液中59-60℃处理1-1.2h，浸蜡处理后，将枸杞叶片切成2-3mm小段，进行包埋；

8、(6)修片和切片；

9、(7)黏片：在黏片前，先将粘片剂做成凸起来的水条状，放上蜡带，吸取多余溶液，将装片置于43-45℃中烘烤至石蜡融化；

10、(8)脱蜡：将装片于43-45℃烘干后，再依次用二甲苯处理两次，每次1-1.5min；用体积分数50％二甲苯和50％无水乙醇混合液处理两次，每次1-1.5min；脱蜡剂处理1.5min；用无水乙醇处理两次，每次1-1.5min；用蒸馏水处理两次，每次1-1.5min；

11、(9)染色与封片：用体积百分浓度1％的番红水溶液染色19-20min后，用蒸馏水洗涤3～5次；用体积百分浓度1％的固绿染色30-32s后，将装片浸泡在体积分数75％乙醇溶液中1-1.5min，取出晾干；封片。

12、优选地，所述脱水为将固定后的材料依次按照体积百分浓度75％的乙醇处理1h、体积百分浓度85％的乙醇处理1h、体积百分浓度95％的乙醇处理1h、体积百分浓度95％的乙醇处理1h、无水乙醇处理1h、无水乙醇处理1h。

13、优选地，所述透明为将脱水后的材料依次放入无水乙醇和二甲苯按体积比1:1混合液、无水乙醇和二甲苯按体积比1:4混合液、纯二甲苯(ⅰ)、纯二甲苯(ⅱ)，各1h。

14、优选地，所述浸蜡与包埋为将透明后的材料加入二甲苯，再加入等体积石蜡液混合后40℃过夜处理，转入100％石蜡液中60℃处理1h，再换入100％石蜡液中60℃处理1h，浸蜡处理后，将枸杞叶片切成2mm小段，进行包埋。

15、优选地，所述将装片置于43-45℃中烘烤至石蜡融化为将装片置于45℃中烘烤至石蜡融化。

16、优选地，所述粘片剂由明胶1.0g、蒸馏水100ml、石炭酸2.0g、甘油15ml组成。

17、优选地，所述脱蜡为将装片于45℃烘干后，再依次用二甲苯处理两次，每次1.5min；用体积分数50％二甲苯和50％无水乙醇混合液处理两次，每次1.5min；脱蜡剂处理1.5min；用无水乙醇处理两次，每次1.5min；用蒸馏水处理两次，每次1min。

18、优选地，所述枸杞为黑果枸杞、宁杞1号、宁杞2号、宁杞3号、宁杞4号、宁杞5号、宁杞6号、宁杞7号、宁杞8号、宁杞9号、宁杞10号、宁农杞1号、宁农杞4号、宁农杞5号、宁农杞9号或蒙杞1号。

19、优选地，所述faa固定液是由5ml福尔马林、5ml冰醋酸、90ml体积百分浓度50％的酒精和5ml甘油组成，其中福尔马林含有体积百分浓度38％的甲醛。

20、优选地，具体步骤如下：

21、(1)取材：选取完整的枸杞叶，在清水中洗净；

22、(2)固定：将洗净的材料放到材料体积20倍faa固定液，置于室温；

23、(3)脱水：将固定后的材料依次放入体积百分浓度75％的乙醇处理1h、体积百分浓度85％的乙醇处理1h、体积百分浓度95％的乙醇处理1h、体积百分浓度95％的乙醇处理1h、无水乙醇处理1h、无水乙醇处理1h，得到脱水后的枸杞叶材料；

24、(4)透明：将脱水后的枸杞叶依次放入无水乙醇和二甲苯按体积比1:1混合液处理1h、无水乙醇和二甲苯按体积比1:4混合液处理1h、纯二甲苯处理1h、纯二甲苯处理1h，得到透明的枸杞叶材料；

25、(5)浸蜡与包埋：向透明后的枸杞叶材料加入二甲苯，再加入等体积石蜡液混合40℃恒温过夜处理，然后倒出二甲苯与石蜡混合溶液，加入100％石蜡液中60℃处理1h，再换入100％石蜡液60℃处理1h，浸蜡处理后，将枸杞叶片切成2mm小段，用包埋机包埋；

26、(6)修片与切片：将石蜡包埋的材料修成矩形，放在切片机上切片，用回旋式切片机将蜡块切成连续的蜡带，厚度调整为10μm；

27、(7)粘片：粘片剂由明胶1.0g、蒸馏水100ml、石炭酸2.0g、甘油15ml组成；在黏片前，先用滴管将粘片剂做成凸起来的水条，再将蜡带放上去，并用滤纸吸取多余溶液，最后将制得的装片放在45℃恒温箱中烘烤至石蜡融化；

28、(8)脱蜡：将制作的装片放在45℃恒温箱中烘干后，依次用二甲苯处理两次，每次1.5min；用体积分数50％二甲苯和50％无水乙醇混合液处理两次，每次1.5min；脱蜡剂处理1.5min；用无水乙醇处理两次，每次1.5min；用蒸馏水处理两次，每次1min；

29、(9)染色与封片：先用体积百分浓度1％的番红水溶液染色20min，用蒸馏水洗涤3～5次，用体积百分浓度1％的固绿染色30s，将装片浸泡在体积分数75％乙醇溶液中1min取出晾干，最后加树胶于材料表面盖上盖玻片，得到枸杞叶的石蜡切片。

30、步骤(1)所述需要完整枸杞叶的目的是避免在后续过程对枸杞叶处理过度。

31、步骤(2)中将材料放到faa固定液固定材料。

32、步骤(3)脱水处理需要用浓度梯度增加的酒精：体积百分浓度75％→85％→95％→100％，且脱水时间缩短，解决了背景技术中的第(1)个问题。

33、步骤(4)透明时间过短，石蜡不易进入组织。透明时间过长，组织硬化，不易切片观察，解决了背景技术中的第(1)个问题。

34、步骤(5)浸蜡是石蜡与二甲苯置换的过程。解决了背景技术中的第(2)个问题

35、步骤(7)解决了背景技术中提到的第(3)个问题。

36、步骤(8)解决了背景技术中提到的第(5)个问题。

37、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

38、(1)取材。选取宁夏枸杞全叶，利于观察宁夏枸杞叶各部分解剖结构。

39、(2)脱水和透明步骤的时间。本发明的乙醇的使用时间，缩短了整个实验周期，避免了对材料初步处理过度。

40、(3)浸蜡步骤时间。延长浸蜡步骤时间，使得石蜡足够长的时间支撑组织细胞，避免组织细胞塌陷和变形。

41、(4)粘片剂制法。采用普特氏粘片剂，比纯水具有粘度，保证粘片不脱落。

42、(5)烤片温度。45℃低于石蜡熔点，避免了石蜡融化，有利于脱蜡步骤顺利进行。且温度刚好使得蜡带粘与载玻片上不脱落，又使得组织细胞固定至佳即不变形不塌陷。

43、(6)脱蜡时间与脱蜡剂的使用。缩短脱蜡时间，避免了组织细胞发生变化，使得组织细胞恢复到原来的形态有利于观察。使用脱蜡剂，二次脱蜡更加彻底。

44、本发明通过对石蜡切片的制备方法进行调整，解决技术中存在的缺点与不足；该方法高效，缩短了实验周期。制作的切片细胞组织完整清晰，利于开展枸杞叶形态结构的深度研究。