一种基于蛋白组学的适用于降解麦糟蛋白的蛋白酶的快速筛选方法与流程

本发明属于啤酒副产物深加工，尤其涉及到一种基于蛋白组学的适用于降解麦糟蛋白的蛋白酶的快速筛选方法。

背景技术：

1、麦糟是啤酒酿造工业中的主要副产物，约占啤酒产量的8-10％(含水量80％左右)。中国的啤酒产量己连续多年世界第一，2023年麦糟产量约300万吨，体量非常大。麦糟含水率高，容易腐败而导致环境污染。目前大多数厂家不经过加工直接出售，附加值低。

2、随着人们健康意识的提升，植物蛋白因不含胆固醇、脂肪含量低于动物蛋白，越来越受消费者青睐。植物蛋白主要来源于大豆，而我国大豆80％长期依赖进口，资源缺乏，亟需开发新的植物蛋白资源。麦糟蛋白质含量丰富

3、(约20-30％)，是优质的植物蛋白资源。麦糟蛋白水解产物-多肽具有良好的生物活性和免疫调节功能。

4、麦糟蛋白构成复杂，包括水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白四大类，氨基酸种类齐全，组成均衡。目前从麦糟中提取蛋白的方法有物理提取、酸碱沉淀法、有机溶剂萃取、蛋白酶法水解等。其中物理提取法提取率相对较低，酸碱沉淀法、有机溶剂萃取两种方法提取效果较好，但存在蛋白变性、化学试剂污染环境、产品中有溶剂残留等问题。蛋白酶法条件相对比较温和，对环境友好，是目前推荐的工艺方法。但是蛋白酶水解速度相对较慢，受制于不同种类的蛋白酶的作用机理不同，其水解效率差异很大，如何筛选到水解速率更加快速、高效的蛋白酶，就成为优化麦糟蛋白制备工艺的关键因素。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于蛋白组学的适用于降解麦糟蛋白的蛋白酶的快速筛选方法，该方法利用组学高通量检测的优势，结合信息学分析方法，通过分析麦糟蛋白和水解酶的蛋白组分和氨基酸序列差异，可提前预判蛋白酶的作用效果，快速筛选高效的适用于麦糟蛋白的降解酶。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种基于蛋白组学的适用于降解麦糟蛋白的蛋白酶的快速筛选方法，包括以下步骤：

3、分步提取用于质谱分析的麦糟蛋白样品，然后对其进行多级处理，并利用液相色谱串联质谱法对其进行分析，通过与蛋白数据库进行比对分析，确定麦糟蛋白的种类并进行定量分析；

4、根据质谱结果，分析麦糟蛋白中的氨基酸种类，识别出相对含量高的氨基酸种类，即确定形成肽键的主要氨基酸；

5、分析多种蛋白酶的底物序列谱及蛋白质家族，确定每种蛋白酶的底物序列偏好性，确定该蛋白酶的酶切位点和酶切的氨基酸种类；

6、将麦糟蛋白形成肽键的主要氨基酸和蛋白酶的酶切位点进行匹配分析，快速筛选出适用于降解麦糟蛋白的蛋白酶。

7、作为优选，分析蛋白酶的底物序列偏好性，确定蛋白酶的氨基酸酶切位点与麦糟蛋白中的氨基酸是否匹配，如果匹配，说明该蛋白酶适合用于降解麦糟蛋白；如果不匹配，则不适合。

8、作为优选，麦糟蛋白的多级处理步骤包括：

9、使用tca-丙酮溶液对麦糟蛋白进行沉淀，离心、丙酮洗涤多次后，烘干沉淀得到麦糟蛋白干粉；

10、使用变性缓冲液对麦糟蛋白干粉样品进行变性处理，加入dtt进行还原，之后加入碘乙酸进行烷基化；

11、利用超滤膜对上述处理样品进行浓缩处理，加入nh4hco3进行中和；

12、随后加入trypsin胰酶进行37℃过夜酶解，之后利用c18 ziptip脱盐柱对酶解样品进行脱盐浓缩处理。

13、作为优选，麦糟蛋白的鉴定与定量步骤包括：

14、采用质谱仪分析洗脱的肽段，利用蛋白数据库进行比对分析，确定蛋白组成及蛋白功能注释以及肽段谱匹配数psm，最终鉴定和定量分析，确定麦糟蛋白的种类。

15、作为优选，分析麦糟蛋白中的氨基酸种类及含量，识别出相对含量高的氨基酸种类，具体步骤为：

16、根据质谱结果，查询高丰度，即psm值较高的蛋白序列，通过提交fasta序列，分析麦糟蛋白中的氨基酸种类，识别出相对含量高的氨基酸种类，即确定形成肽键的主要氨基酸。

17、作为优选，分析多种蛋白酶的底物序列谱及蛋白质家族，确定每种蛋白酶的底物序列偏好性，确定该蛋白酶的酶切位点和酶切的氨基酸种类，具体步骤为：

18、在merops网站中，根据蛋白酶的accession号进行搜索或用name进行模糊搜索，根据家族在已有序列谱中进行搜索，确定蛋白酶的底物序列谱和偏好性，确定蛋白酶的酶切位点和酶切的氨基酸种类。

19、作为优选，所述蛋白酶选自1#-8#蛋白酶中的至少一种，其依次为来源于黑曲霉(aspergillus niger)的酸性蛋白酶、来源于枯草杆菌(bacillus subtilis)的酸性蛋白酶、来源于芽孢杆菌(bacillus)的中性蛋白酶、来源于栖土曲霉

20、(aspergillus terricola)的木瓜蛋白酶、来源于枯草杆菌(bacillus subtilis)的中性蛋白酶、来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的中性蛋白酶neutrase、来源于地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的碱性蛋白酶、来源于枯草杆菌

21、(bacillus subtilis)的碱性蛋白酶。

22、本发明还提供了一种基于蛋白组学的优化的麦糟多肽的制备方法，将根据上述任一项技术方案所述的方法筛选得到的适用于降解麦糟蛋白的蛋白酶用于麦糟多肽的制备中。

23、作为优选，包括以下步骤：

24、取一定量的湿麦糟，将其烘至绝干，计算湿麦糟的水分含量；

25、根据湿麦糟的水分含量，依据其加水将湿麦糟调制成干重为3-8％的溶液，机械粉碎处理；

26、以干糟重量计，向麦糟溶液中加入0.5-3％匹配分析得出的适用于降解麦糟蛋白的蛋白酶以及0.1-2％纤维素复合酶，充分搅拌酶解；

27、待酶解结束后，灭活，冷却至室温，离心过滤或板框压滤，得到一次上清液和一次沉淀，向一次沉淀中加水，搅拌洗涤，再次离心过滤或板框压滤，得到二次上清液，合并两次上清液，得到麦糟蛋白酶解液；

28、对所得麦糟蛋白酶解液进行超滤膜处理，干燥，得到麦糟肽粉。

29、作为优选，酶解温度为55-60℃，酶解时间为3-6h，搅拌速率为500-1000rpm。

30、作为优选，酶解结束后升温至85-95℃,维持10-15min，灭活，冷却至室温；分离酶解液时采用高速离心或板框压滤，其中，高速离心的速率为8000-10000rpm，时间为10-15min，板框压滤机的过滤压力为0.5mpa。

31、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

32、本发明提供了一种基于蛋白组学的适用于降解麦糟蛋白的蛋白酶的快速筛选方法，解决了传统筛选酶效率低的问题。传统方法需要通过实际效果进行酶的筛选评价，结果滞后。当面对大量待选酶筛选时，效率很低。而本发明利用组学高通量检测的优势，结合信息学分析方法，通过分析麦糟蛋白和水解酶的蛋白组分和氨基酸序列差异，可提前预判蛋白酶的作用效果，快速筛选高效的适用于麦糟蛋白的降解酶。