一种粮油生物毒素快速检测芯片、检测方法及其制备方法

本发明属于，具体涉及一种粮油生物毒素快速检测芯片、检测方法及其制备方法。

背景技术：

1、农作物在生长、收获、贮存及加工过程中，受环境、加工生产因素影响，可能发生霉变，从而初级农产品及由其加工的半成品、成品中可能含有有毒有害物质，影响人的身体健康。

2、农作物发生霉变后可能含有黄曲霉毒素b1（afb1）、玉米赤霉烯酮（zen）、赭曲霉毒素a（ota）及呕吐毒素（don）。其中，黄曲霉毒素b1主要损害人和动物的肝脏、肾脏，为ⅰ类致癌物质；玉米赤霉烯酮具有雌激素的特性，对人和动物的生殖功能和免疫功能产生抑制作用；赭曲霉毒素a急性毒性强，具有致畸性，但未发现其具有致癌和致突变作用；呕吐毒素又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇、脱氧瓜萎镰菌醇，当人摄入了被呕吐毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统，甚至造成死亡。

3、目前，粮油检测上述有毒有害物质多采用高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、近红外光谱法。但以上测定方法需要借助精密仪器，且操作复杂、检测时间长。因此，迫切需要一种快速、便捷、准确可靠的检测方法。

4、作为粮油质量控制的快速筛查手段，现有技术中已有生物毒素的检测芯片及其检测方法，然而现有生物毒素检测芯片及其检测方法具有以下几个缺陷：

5、传统的生物毒素检测芯片，一张芯片不能检测多种生物毒素，需要多个检测芯片才能完成黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a及呕吐毒素的检测，费时费力；第二，大部分芯片需要配套仪器进行读数检测，操作繁琐；第三，现有的荧光芯片灵敏、高效，但对操作人员的专业性要求较高，样品基质对其检测结果影响较大。

6、因此，现有技术中亟需一种可一次完成多种生物毒素检测、操作简单、可直接肉眼观察检测结果、对操作人员专业性要求低的粮油生物毒素快速检测芯片及其制备方法。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种可一次完成多种生物毒素检测、操作简单、可直接肉眼观察检测结果、对操作人员专业性要求低的粮油生物毒素快速检测芯片。

2、本发明的第一目的是通过以下技术方案实现的：一种粮油生物毒素快速检测芯片，包括芯片底盘及盖设于芯片底盘上的芯片上盖，所述芯片上盖的中心设置有加样孔，在所述芯片上盖上，在以加样孔为中心的圆上均匀设置有五个以上的显色孔；芯片底盘的中心对应于所述加样孔设置有加样垫安装位，所述芯片底盘上对应于所述显色孔均匀设置有五个以上的从加样垫安装位处向所述芯片底盘的边缘延伸的试纸条安装位；还包括分别用于检测黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a和呕吐毒素的检测试纸条及阴性质控试纸条，所述加样垫安装位设置有加样垫，所述检测试纸条及所述阴性质控试纸条设置于所述试纸条安装位，所述检测试纸条及所述阴性质控试纸条的一端与所述加样垫的边缘触接；所述芯片底盘与所述芯片上盖连接至一起，将所述加样垫、所述检测试纸条及所述阴性质控试纸条压紧至所述芯片底盘与所述芯片上盖之间。

3、所述检测试纸条包括pvc底板及从左到右胶接于所述pvc底板上表面的样品垫、金标结合垫、nc膜及吸水纸，所述样品垫的右端部叠置于所述金标结合垫的左端部的上方，所述金标结合垫的右端部叠置于所述nc膜的左端部的上方，所述吸水纸的左端部叠置于所述nc膜的右端部的上方，所述样品垫与所述加样垫触接。

4、所述样品垫叠置于所述金标结合垫上的一段长1mm，所述金标结合垫叠置于所述nc膜上的一段长1mm，所述吸水纸叠置于所述nc膜上的一段长1mm。

5、所述样品垫为玻璃纤维材质，样品垫上均匀喷涂样品垫处理液后，置于37℃干燥箱干燥4h，所述样品垫处理液是以ph为7.4磷酸盐缓冲液质量为基准配制，所述样品垫处理液包括磷酸缓冲液、1.5% bsa、0.3%吐温20、5%蔗糖及2.5%海藻糖；

6、金标结合垫为聚酯纤维材质，金标结合垫上喷涂金标结合垫处理液预处理后，置于37℃干燥箱干燥3h，所述金标结合垫处理液是以ph为7.4磷酸盐缓冲液质量为基准配制，所述金标结合垫处理液包括磷酸盐缓冲液及1%peg20000聚乙二醇；配制重悬液，以ph为7.4磷酸盐缓冲液质量为基准配制，所述重悬液包括磷酸盐缓冲液、0.8%peg20000聚乙二醇、2%吐温20及10%nacl；采用柠檬酸三钠法制备质量分数为0.01%、粒径为30 nm的胶体金溶液，分别用黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a及呕吐毒素的单克隆抗体标记胶体金溶液；将标记好抗体的胶体金溶液放置4℃冷藏反应12h后，以8000r/min、4℃离心20 min，弃去上层清液，吸取重悬液，将金标抗体重悬，利用喷金仪喷涂于预处理好的金标结合垫上，随后将其置于37℃环境干燥4h；

7、黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a及呕吐毒素对应包被抗原的浓度分别为0.2 mg/ml、0.2 mg/ml、0.5 mg/ml及0.2 mg/ml，将包被抗原均匀喷涂于不同nc膜上的t线处，浓度0.3 mg/ml羊抗鼠igg二抗均匀喷涂于nc膜的c线处。

8、阴性质控试纸条利用免疫层析胶体金技术制备的试纸条，胶体金标记羊抗鼠igg与硝酸纤维素膜上包被的igg结合显示红色条带，它不受其他生物毒素项目干扰，在任何条件下都显示红色条带，并可与三种生物毒素进行颜色比对，从而可直观目视合格与否。阴性质控试纸条为现有技术，在此不进行赘述。

9、所述试纸条安装位设置有试纸条支撑框，所述芯片底盘设置有多个前侧面限位沿及多个后侧面限位沿，前侧面限位沿位于所述试纸条支撑框前端的左右两侧，后侧面限位沿位于所述试纸条支撑框后半段的左右两侧，所述试纸条支撑框的前后两端分别设置有前限位沿和后限位沿，所述芯片底盘的中心设置有加样垫支撑圆凸。

10、所述芯片底盘设置有多个凸柱，所述芯片上盖设置有多个连接筒，所述凸柱伸入相应的所述连接筒中，所述芯片上盖通过凸柱与连接筒的配合与所述芯片底盘连接。

11、所述芯片上盖上设置有六个显色孔，所述芯片底盘对应于这六个显色孔设置有六个所述试纸条安装位。

12、本发明的第二目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种一种可一次完成多种生物毒素检测、操作简单、可直接肉眼观察检测结果、对操作人员专业性要求低的粮油生物毒素快速检测方法。

13、本发明的第二目的是通过以下技术方案实现的：一种粮油生物毒素快速检测方法，包括如下步骤：

14、1）样品处理：

15、称取粉碎的样品5g于50ml离心管中，加入8ml提取剂涡旋震荡2 min，4000r/min离心5 min；取离心后的上清液5ml于10ml离心管内，55℃下空气或氮气吹干；吸取500μl复溶液于吹干后的10ml离心管内，涡旋震荡1 min后待检；

16、2）样品检测：

17、取出检测芯片，水平放置于观察者正面；吸取全部待检样液滴于检测芯片中央的加样孔中，8-10 min待显色区颜色清晰稳定后，读取结果，结果在15 min内有效；

18、3）结果判断：

19、若检测线显色区域红色条带颜色深于质控线则为阴性，若检测线显色区域无红色条带或其颜色明显浅于质控线则为阳性。

20、本发明的第三目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种粮油生物毒素快速检测芯片的制备方法。

21、本发明的第三目的是通过以下技术方案实现的：一种粮油生物毒素快速检测芯片的制备方法，包括如下步骤：

22、1）溶液配制：

23、以ph为7.4磷酸盐缓冲液质量为基准配制相关溶液；

24、样品垫处理液由磷酸缓冲液、1.5% bsa、0.3%吐温20、 5%蔗糖及2.5%海藻糖配制而成；

25、金标结合垫处理液由磷酸盐缓冲液及1%peg20000聚乙二醇配制而成；

26、重悬液由磷酸盐缓冲液、 0.8%peg20000聚乙二醇、2%吐温20及10%nacl配制而成；

27、2）检测试纸条的预处理

28、采用样品垫处理液均匀喷涂玻璃纤维样品垫后，置于37℃干燥箱4h，干燥；

29、采用金标结合垫处理液均匀喷涂聚酯纤维金标结合垫后，置于37℃干燥箱3h，干燥；

30、3）胶体金溶液的制备：

31、采用柠檬酸三钠法制备质量分数为0.01%、粒径为30 nm的胶体金溶液：取洁净的250ml三角瓶一支，加入100ml双蒸水，再加入1ml质量分数为1%氯金酸溶液，置于烤炉加热至沸腾，取质量分数1%柠檬酸三钠加入至沸水内，继续加热沸腾10min后取下，冷却至室温，于4℃避光保存；

32、4）免疫胶体金试纸条制备

33、取多只洁净的1.5 ml离心管，分别加入1 ml胶体金溶液，用 0.1 mol/l k2co3水溶液调节反应液的ph，然后分别加入黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a及呕吐毒素单克隆抗体，混匀后室温振荡反应10 s，静置10 min，分别加入50μl 质量分数为10%的 bsa溶液；

34、其中，黄曲霉毒素b1单克隆抗体加入量为12μg，对应的k2co3水溶液加入量为7μl；玉米赤霉烯酮单克隆抗体加入量为6μg，对应的k2co3水溶液加入量为3μl；赭曲霉毒素a单克隆抗体加入量为12μg，对应的k2co3水溶液加入量为4μl；呕吐毒素单克隆抗体加入量为10μg，对应的k2co3水溶液加入量为7μl；

35、5）胶体金的处理

36、将标记好抗体的胶体金溶液放置4℃冷藏反应12h后，以8000r/min、4℃离心20min，弃去上层清液，吸取800μl重悬液，将金标抗体重悬，利用喷金仪喷涂于预处理好的金标结合垫上，随后置于37℃环境干燥4h；

37、6）抗原的包被

38、黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a及呕吐毒素对应包被抗原的浓度分别为0.2 mg/ml、0.2 mg/ml、0.5 mg/ml及0.2 mg/ml，喷涂量1μl/cm，将包被抗原均匀喷涂于不同nc膜上的t线处，浓度0.3 mg/ml羊抗鼠igg二抗均匀喷涂于nc膜的c线处，喷涂量1μl/cm；

39、7）检测试纸条组装

40、从左到右依次将样品垫、金标结合垫、nc膜及吸水纸胶接于pvc底板上表面，样品垫的右端部叠置于金标结合垫的左端部的上方，样品垫叠置于金标结合垫上的一段长1mm，金标结合垫的右端部叠置于所述nc膜的左端部的上方，金标结合垫叠置于所述nc膜上的一段长1mm，所述吸水纸的左端部叠置于所述nc膜的右端部的上方，吸水纸叠置于nc膜上的一段长1mm；用切条机切割成宽度为3.5 mm的试纸条，干燥；

41、8）检测芯片组装

42、芯片上盖的中心设置有加样孔，在芯片上盖上，在以加样孔为中心的圆上均匀设置有五个以上的显色孔；芯片底盘的中心对应于加样孔设置有加样垫安装位，芯片底盘上对应于显色孔均匀设置有五个以上的从加样垫安装位处向所述芯片底盘的边缘延伸的试纸条安装位；将用于检测黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a和呕吐毒素的检测试纸条及阴性质控试纸条分别放置于试纸条安装位，将加样垫置于加样垫安装位，检测试纸条及阴性质控试纸条的一端与加样垫的边缘触接；芯片底盘设置有多个凸柱，芯片上盖设置有多个连接筒，凸柱伸入相应的连接筒中，芯片上盖通过凸柱与连接筒的配合与芯片底盘连接至一起，将加样垫、检测试纸条及阴性质控试纸条压紧至芯片底盘与芯片上盖之间。

43、本发明的有益效果是：本发明运用胶体金免疫层析法，通过对胶体金试纸条制备条件的优化，在最佳条件下，制备出性能较好的不同生物毒素检测试纸条，一张芯片盘可任意组合不同检测项目，不同生物毒素检测试纸条有机组合后，配合样品前处理，可一次性完成黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a及呕吐毒素中的1-4种生物毒素检测，前处理简单，操作方便，可直接肉眼观察检测结果，对操作人员专业性要求低，结果准确。