一种穿膜肽修饰的柔性纳米磁链及其制备方法

本发明涉及一种穿膜肽修饰的柔性纳米磁链及其制备方法。

背景技术：

1、胞外囊泡具有独特的盘状或杯状结构，存在于多种天然体液中，包括尿液、血液、唾液等，通过携带的蛋白质、脂质、核酸和代谢物等，发挥细胞间通讯作用，参与细胞间互作、细胞迁移、肿瘤侵袭等生物学过程。大量研究表明胞外囊泡及其内容物是多种疾病的早期诊断标志物，在临床和治疗方面极具前景。目前已经在癌症、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等多种疾病的胞外囊泡中确定了诊断标志物。超速离心是胞外囊泡提取的金标准方法。但通过上述方法提取的胞外囊泡，提取率稳定性差，批次效应高，同时在提取过程中无法完全去除高密度脂蛋白、其他细胞外蛋白和碎片的干扰。

2、磁性纳米颗粒，尤其是四氧化三铁，广泛用于磁共振成像、传感、靶向药物递送和生物分离。由于其比表面积高、丰富的亲和位点、快速磁响应、稳定的物理、化学性质以及灵活的表面功能化，磁性纳米材料已成为富集翻译后修饰蛋白质和胞外囊泡的高效方法和手段。目前，zhang等人制备出了二氧化钛和谷胱甘肽功能化的磁珠富集胞外囊泡，利用二氧化钛的金属氧化物亲和层析机理捕获胞外囊泡。sun等人通过在四氧化三铁磁性粒子表面修饰钛离子和1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷酸-乙醇胺，利用疏水末端脂肪链通过疏水相互作用快速锚定到胞外囊泡的磷脂膜上，钛离子与膜上的磷酸基团具有强烈的亲和力相互作用，协同捕获胞外囊泡。jiao等人制备了氨基化修饰的磁性石墨烯，与大环螯合配体结合，进一步螯合钛离子来捕获胞外囊泡。zhang等人制备出了氨基化的金属有机框架纳米材料，通过植酸在金属有机骨架上引入磷酸基团，最后将钛离子固定在材料表面，利用锆离子和钛离子增强材料与磷脂双层的螯合作用，提高胞外囊泡的捕获效率。上述几种富集胞外囊泡的纳米材料由于与胞外囊泡的作用力少，因此在捕获后去除非特异性吸附的后处理过程中，极易丢失已捕获的胞外囊泡；且通过螯合作用修饰的钛离子来捕获胞外囊泡，在后续的清洗过程中，钛离子可能会从材料上丢失，造成捕获效率的降低和材料的不稳定性。

技术实现思路

1、发明目的：本发明目的旨在提供一种穿膜肽修饰的柔性纳米磁链，该纳米磁链柔性可弯曲且磁链长度可调节，能够与生物样本中的胞外囊泡形成更多的结合位点，从而增强纳米磁链与胞外囊泡的相互作用力，显著提高胞外囊泡的回收率和纯度；同时细长形态的纳米磁链能够减少对体液中其他生物组分的捕获，从而更加有效、稳定的特异性捕获胞外囊泡；本发明另一目的旨在提供上述柔性纳米磁链的制备方法。

2、技术方案：本发明所述的穿膜肽修饰的柔性纳米磁链，所述柔性纳米磁链以呈线形排列的磁性纳米粒子为内核，在呈线形排列的磁性纳米粒子外包覆有穿膜肽修饰的聚合物壳层。

3、本发明柔性纳米磁链具有小的横向直径和细长的径向结构，柔性纳米磁链长度在2μm～80μm之间，可以根据需要进行调整；柔性纳米磁链中磁性纳米粒子的直径为50nm～300nm。

4、其中，所述磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米颗粒；所述聚合物壳层为修饰有穿膜肽功能基团的聚丙烯酸壳层。

5、上述柔性纳米磁链的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)将分散有磁性纳米粒子的乙二醇溶液与聚合单体、交联剂和光引发剂充分混合，在聚合反应前，单体与磁性纳米粒子表面的聚乙烯吡咯烷酮通过氢键作用在粒子周围形成高浓度区域；然后在外磁场作用下，这些粒子组装为一维磁性的有序结构，同时富集了高浓度单体，随后在紫外光的引发下单体发生快速聚合，形成表面富含羧基的纳米磁链；

7、(2)将步骤(1)所得产物分散在2-吗啉乙磺酸溶液中，再往其中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活化纳米磁链上的羧基，活化后往其中加入nh2-peg-sh，nh2-peg-sh与纳米磁链上的羧基发生酰胺反应得到巯基化的纳米磁链；

8、(3)将步骤(2)所得产物分散在n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸溶液中，再往其中加入mal-peg-穿膜肽，纳米磁链上的巯基与mal-peg-穿膜肽的马来酰亚胺发生点击化学反应，在柔性纳米磁链表面修饰穿膜肽功能基团，得到本发明穿膜肽修饰的柔性纳米磁链。

9、其中，步骤(1)中，磁性纳米粒子尺寸为50nm～300nm；乙二醇溶液中，磁性纳米粒子的浓度为0.1～20mg/ml。

10、其中，步骤(1)中，所述单体为丙烯酸、甲基丙烯酸或2-羟丙基丙烯酸中的一种；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酰胺或亚甲基双丙烯酰胺中的一种；引发剂为2-羟基-2-甲基丙苯酮。

11、其中，步骤(1)中，磁场强度为100～600gas，磁场作用时间为10s～30min；光源强度为50-200mw/cm2，照射时间为30s～30min。

12、柔性纳米磁链的可变长度范围通过使用不同浓度的磁性纳米粒子、不同的外加磁场强度、不同的外加磁场作用时间、不同的外源光照射时间的任何一种或几种方式实现。

13、其中，步骤(2)中，巯基化分子nh2-peg-sh中peg的分子量为100～4000。

14、其中，步骤(3)中，所述mal-peg-穿膜肽中peg的分子量为100～4000；穿膜肽分子为r8多肽、r9多肽、tat多肽、核定位信号序列肽nls中的任何一种。

15、本发明柔性纳米磁链是在外加磁场和外加紫外光源下，利用磁性纳米粒子沿磁感线整齐排列形成单链结构和自由基聚合反应，形成纳米磁链，去掉外加磁场后，形成表面富含羧基的柔性纳米磁链；随后，利用与nh2-peg-sh的酰胺反应生成巯基化的磁链；最后，通过巯基与mal-peg-nh2的马来酰亚胺的点击化学反应，在柔性纳米磁链表面接枝穿膜肽(通过修饰的穿膜肽特异性富集胞外囊泡)。

16、有益效果：相比于现有技术，本发明具有如下显著的优点：(1)相比常规的磁性纳米粒子，纳米磁链具有更强的磁响应强度，能够实现更快速的捕获和磁分离。(2)本发明所制备的磁链是柔性可弯曲的，经功能化分子修饰后，能够与生物样本中的胞外囊泡形成更多的结合位点，从而增强纳米磁链与胞外囊泡的相互作用力，提高胞外囊泡的回收率和纯度。(3)本发明柔性纳米磁链具有更高的比表面积和更高密度的穿膜肽功能基团，非常适用于微量体液，能够增加目标物的捕获效率和捕获率稳定性，并且在特异性捕获后在除去非特异性吸附的后处理过程中，能够有效减少已捕获胞外囊泡的丢失。(4)本发明柔性纳米磁链能够解决现有常规磁性纳米粒子在胞外囊泡捕获存在的缺点，能够提高复杂微量生物体液中胞外囊泡的捕获效率，实现快速、高特异性、高产率的富集胞外囊泡。

技术特征：

1.一种穿膜肽修饰的柔性纳米磁链，其特征在于：所述柔性纳米磁链以呈线形排列的磁性纳米粒子为内核，在呈线形排列的磁性纳米粒子外包覆有穿膜肽修饰的聚合物壳层。

2.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的柔性纳米磁链，其特征在于：所述柔性纳米磁链长度在2μm～80μm之间，所述柔性纳米磁链中磁性纳米粒子的直径为50nm～300nm。

3.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的柔性纳米磁链，其特征在于：所述磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米颗粒；所述聚合物壳层为修饰有穿膜肽功能基团的聚丙烯酸壳层。

4.权利要求1所述的柔性纳米磁链的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的柔性纳米磁链的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，磁性纳米粒子尺寸为50nm～300nm；分散液中，磁性纳米粒子的浓度为0.1～20mg/ml。

6.根据权利要求4所述的柔性纳米磁链的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述单体为丙烯酸、甲基丙烯酸或2-羟丙基丙烯酸中的一种；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酰胺或亚甲基双丙烯酰胺中的一种；引发剂为2-羟基-2-甲基丙苯酮。

7.根据权利要求4所述的柔性纳米磁链的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，磁场强度为100～600gas，磁场作用时间为10s～30min。

8.根据权利要求4所述的柔性纳米磁链的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，光源强度为50～200mw/cm2，照射时间为30s～30min。

9.根据权利要求4所述的柔性纳米磁链的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，巯基化分子nh2-peg-sh中peg的分子量为100～4000。

10.根据权利要求4所述的柔性纳米磁链的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述mal-peg-穿膜肽中peg的分子量为100～4000；穿膜肽分子为r8多肽、r9多肽、tat多肽、核定位信号序列肽nls中的任何一种。

技术总结本发明公开了一种穿膜肽修饰的柔性纳米磁链，所述柔性纳米磁链以呈线形排列的磁性纳米粒子为内核，在呈线形排列的磁性纳米粒子外包覆有穿膜肽修饰的聚合物壳层。本发明还公开了上述柔性纳米磁链的制备方法。本发明柔性纳米磁链能够解决现有常规磁性纳米粒子在胞外囊泡捕获存在的缺点，能够提高复杂微量生物体液中胞外囊泡的捕获效率，实现快速、高特异性、高产率的富集胞外囊泡。技术研发人员：谢卓颖,李铭洋,孙杰,宋小荣,蔡雨含,顾忠泽受保护的技术使用者：东南大学技术研发日：技术公布日：2024/7/25