保元汤基准样品中肉桂及生姜的活性成分的检测方法与流程

本发明属于药品检测的，具体涉及保元汤基准样品中肉桂及生姜的活性成分的检测方法。

背景技术：

1、保元汤为《古代经典名方目录（第一批）》公布的100首方剂的第71首保元汤，源于明朝孙志宏所著的《简明医懿》。其处方制法为人参一钱、黄芪二钱、甘草五分、肉桂二分，右加生姜一片，水煎服。其中人参固内，大补元气、补脾益肺，为君药；黄芪补肺固表、增强脱毒透表之力，为臣药；甘草补脾益气、清热解毒、调和诸药，为佐使；肉桂温通血脉，引他药如血分，鼓舞气血运行而托毒透疮，温肾助阳，使气血充达周身则毒易外散，为佐药；生姜取其温中之效，助肉桂温阳之力，为使药。保元汤具有补齐温阳的功效，主治元气不足证，症见倦怠乏力，面色晄白，少气畏寒，不欲饮食。保元汤现代研究应用广泛，涉及心血管系统、免疫调节、血液系统作用等，临床应用主要包括冠心病、再生障碍性贫血、慢性肾功能衰竭、慢性肾炎、白细胞减少等多种疾病。

2、目前，保元汤的质量控制多以指纹图谱检测，以人参中的皂苷类成分，黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷及黄芪甲苷成分，甘草中的皂苷类及甘草酸铵等成分，作为特征峰和质量控制指标。但是肉桂、生姜作为本方中的使药，均含有挥发油成分，其在保元汤中的保留情况，对于保元汤的质量控制具有十分重要的意义，但是以上都无法对其进行质量控制。

3、cn111487343a公开了一种保元汤制剂指纹图谱的建立方法，采用uplc-dad-elsd法，通过dad检测到41个共有峰，els检测到19个共有峰，归属了12个已知峰，流动相a为乙腈，流动相b为醋酸铵缓冲溶液，色谱柱为agilent proshell 120ec-c18，进行梯度洗脱，检测其中的人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、甘草苷、甘草酸单铵盐、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸，其并未对主要的挥发性成分桂皮醛进行研究，且归属的成分除肉桂酸外均为人参、黄芪、甘草中的成分，无法整体反映保元汤中各药味成分的保留情况。

4、cn114184719a公开了一种保元汤的双波长指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱，采用高效液相色谱法检测，流动相a为乙腈，流动相b为磷酸水溶液，采用梯度洗脱，色谱柱为菲罗门c18柱，检测人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、6-姜辣素，保元汤供试品指纹图谱共有峰有18个，峰1、10和13来自黄芪，峰2、3、4、5、7、9、12、15、17来自甘草、8、14和16来自人参，峰18来自生姜，6号峰是黄芪和甘草共有，11号峰是人参和甘草共有，其并未对主要的挥发性成分桂皮醛进行研究，且归属的成分除6-姜辣素外均为人参、黄芪、甘草中的成分，无法整体反应保元汤中各药味成分的保留情况。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供保元汤基准样品中肉桂及生姜的活性成分的检测，有效检测肉桂、生姜中的多种成分，方法简单、稳定、专属性强、精密度高、耐用性好。

2、本发明所述的保元汤基准样品中肉桂及生姜的活性成分的检测方法，包括对肉桂及生姜的活性成分桂皮醛、肉桂酸、6-姜辣素的超高液相色谱的定量检测方法，以及对肉桂及生姜的活性成分肉桂醇、香豆素、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的指纹图谱的定性检测方法。

3、对肉桂及生姜的活性成分桂皮醛、肉桂酸、6-姜辣素的超高液相色谱的定量检测方法，包括如下步骤：取保元汤基准样品供试品和对照品进行检测，其中的对照品为桂皮醛、肉桂酸、6-姜辣素，采用超高效液相色谱法检测，其中的色谱条件包括：采用c18色谱柱，以0.05wt%-0.15wt%甲酸溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序为：0-6min，70%（体积）流动相a，30%（体积）流动相b；6-15min，70%（体积）→30%（体积）流动相a，30%（体积）→70%（体积）流动相b；15-18min，30%（体积）流动相a，70%（体积）流动相b；根据检测获得保元汤基准样品中肉桂及生姜的活性成分桂皮醛、肉桂酸、6-姜辣素的含量。

4、色谱条件还包括：流速：0.27-0.33ml/min；柱温：23-35℃；进样量：2μl；检测波长：桂皮醛290nm、肉桂酸278nm、6-姜辣素282nm；检测器：dad。

5、对照品制成的对照品溶液中桂皮醛的浓度为10μg/ml，肉桂酸浓度为10μg/ml，6-姜辣素浓度为50μg/ml。

6、对肉桂及生姜的活性成分肉桂醇、香豆素、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的指纹图谱的定性检测方法，包括如下步骤：取保元汤基准样品供试品和对照品进行检测，其中的对照品为肉桂醇、香豆素、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚，采用超高效液相色谱法检测，其中的色谱条件包括：采用c18色谱柱，以0.05wt%-0.15wt%甲酸溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序为：0-40min，85%（体积）流动相a，15%（体积）流动相b；40-60min，85%（体积）→20%（体积）流动相a，15%（体积）→80%（体积）流动相b；60-70min，20%（体积）流动相a，80%（体积）流动相b；根据检测获得保元汤基准样品中肉桂及生姜的活性成分肉桂醇、香豆素、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的出峰顺序以及出峰时间。所述的流动相的%均指的是体积百分比。

7、色谱条件还包括：流速：0.27-0.33ml/min；柱温：23-35℃；进样量：2μl；检测波长：270-290nm；检测器：dad。

8、对照品制成的对照品溶液中肉桂醇、香豆素、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的浓度均为为10-50μg/ml。

9、保元汤基准样品供试品所制成的供试品溶液是由保元汤水煎液、浓缩液、或冻干粉制得的，其中的保元汤由人参、黄芪、甘草、肉桂、生姜组成。

10、供试品溶液的制备方法为：将保元汤水煎液或浓缩液的稀释液或冻干粉的水溶液，加入乙酸乙酯萃取，干燥，残渣加甲醇溶解，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

11、c18色谱柱型号为welch ultimate uhplc lp-c18，规格为2.1×100mm，填料直径为1.8μm。

12、本发明中所述保元汤制备为：人参3.73g，黄芪7.46g、甘草1.87g、肉桂0.75g、生姜3g，水煎煮。本发明中所述保元汤基准样品包括保元汤煎液和经浓缩后的浓缩液以及干燥后的粉末样品。

13、具体的，所述的保元汤基准样品中肉桂及生姜的活性成分的检测方法，包括以下步骤：

14、（1）制备保元汤供试品溶液：将配方为人参3.73g，黄芪7.46g、甘草1.87g、肉桂0.75g、生姜3g的原料混合后加水煎煮，制得保元汤水煎液，取水煎液10ml，用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，40℃旋蒸干燥，残渣加甲醇溶解并稀释至5ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

15、（2）对肉桂及生姜的活性成分桂皮醛、肉桂酸、6-姜辣素的超高液相色谱的定量检测方法：分别取桂皮醛、肉桂酸、6-姜辣素对照品适量，精密称定，配制成含桂皮醛、肉桂酸浓度为10μg/ml、6-姜辣素浓度为50μg/ml的混合对照品溶液；

16、选取色谱条件为：色谱柱：welch ultimate uhplc lp-c18（2.1×100mm，1.8μm）；

17、检测器：dad；

18、流动相：0.1wt%甲酸溶液（流动相a），乙腈（流动相b），进行梯度洗脱；

19、流速：0.3ml/min；

20、柱温：30℃；

21、进样量：2μl；

22、检测波长：桂皮醛290nm、肉桂酸278nm、6-姜辣素282nm；

23、测定：将步骤（1）的供试品溶液和以上制备的混合对照品溶液注入超高效液相色谱仪，按照以上色谱条件进行检测，记录色谱图，计算得到供试品溶液中的桂皮醛、肉桂酸、6-姜辣素的含量。

24、（3）对肉桂及生姜的活性成分肉桂醇、香豆素、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的指纹图谱的定性检测方法：分别取肉桂醇、香豆素、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚对照品，精密称定，配制成浓度分别为10μg/ml的混合对照品溶液；

25、选取色谱条件为：色谱柱：welch ultimate uhplc lp-c18（2.1×100mm，1.8μm）；

26、流动相：0.1wt%甲酸溶液（流动相a），乙腈（流动相b），进行梯度洗脱；

27、检测器：dad；

28、流速：0.3ml/min；

29、柱温：30℃；

30、进样量：2μl；

31、检测波长：290nm；

32、检测：将步骤（1）的供试品溶液和以上混合对照品溶液注入超高效液相色谱仪，按照以上色谱条件进行检测，记录色谱图，分别得到肉桂醇、香豆素、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的出峰时间，出峰的顺序。

33、本发明主要对保元汤中肉桂、生姜中的成分进行研究，结合分析保元汤中可能含有的肉桂、生姜中的所有成分进行了方法开发，因保元汤的处方量小，各成分浓度较低，挥发性成分对浓缩条件要求较为苛刻，本发明考察了供试品溶液的制备方式，考虑到肉桂、生姜中的成分多为脂溶性成分，供试品溶液制备时选择了乙酸乙酯萃取提纯，减少干扰，浓缩增大浓度，提高方法的检出能力，由于目前经典名方项目对挥发油的研究极为重视，本方中针对桂皮醛的含量研究，意在表征保元汤中挥发油的保留情况。

34、与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

35、（1）本发明的保元汤基准样品中肉桂及生姜的活性成分的检测方法，基于保元汤中的肉桂以及生姜成分，同时定量检测出其中的桂皮醛、肉桂酸、6-姜辣素的三种主要活性成分的含量，检测准确，效率高。

36、（2）本发明的保元汤基准样品中肉桂及生姜的活性成分的检测方法，基于保元汤中的肉桂以及生姜成分，同时定性检测出其中的肉桂醇、香豆素、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚五种主要活性成分，分离度高，检测准确，检测效率高。

37、（3）本发明的保元汤基准样品中肉桂及生姜的活性成分的检测方法，通过定性和定量的协同作用，高效的控制保元汤中的肉桂及生姜的活性成分的质量，检测全面。