木豆提取物及其菧类活性成分的应用

本发明属于农业和医药，涉及诺卡氏菌病的防治，具体涉及木豆提取物及其活性成分在诺卡氏菌病防治药物制备中的应用。

背景技术：

1、诺卡菌属是广泛存在于土壤和水生环境中的革兰氏阳性细菌。已知有超过50种诺卡菌能够导致动物或人类的诺卡菌病。诺卡菌病主要表现为三种形式：原发性皮肤感染、肺部感染和播散性感染。诺卡菌病的治疗面临挑战，主要依赖于有限的抗生素种类，需要数月或数年的抗菌治疗。由于新药疗效报告有限、治疗失败和药物耐药性，目前尚未建立诺卡菌病的标准治疗方法。因此，急需开发安全有效且环境友好的预防和治疗诺卡氏菌病的方法。

2、近年来鰤鱼诺卡氏菌(nocardia seriolae)已成为主要的鱼类诺卡菌病病原体，引起各种症状，如皮肤溃疡、腹部肿胀、鱼鳃以及肝脏、心脏、脾脏和肾脏等器官明显白色结节。鰤鱼诺卡氏菌感染的发病率在各种鱼类中增加，经济价值高的的大口黑鲈尤其受到影响，导致水产养殖业的重大经济损失。鰤鱼诺卡氏菌能够引起淡水养殖的乌鳢、大口黑鲈、罗非鱼以及海水养殖的鰤、鲷、鲳、石斑鱼和大黄鱼等20多种重要经济鱼类的感染。随着近年来水厂养殖业的不断发展，养殖集约化程度的不断提高及各地鱼种种苗的交流不断增加，诺卡氏菌病的传播范围变得更广，发病率更高，危害程度更深，给水产养殖业造成巨大的经济损失。

3、木豆(cajanus cajan(l.)millsp)，俗称鸽子豆，是全球第六大食用豆类。它主要分布在南亚和东南亚，特别是在印度、缅甸和中国等国家。在传统医学中，木豆的叶子被用来治疗伤口、疟疾、咳嗽和腹痛。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决诺卡氏菌病治疗过程中普遍采用抗生素，抗生素过度使用出现耐药性；鱼类诺卡氏菌病防治困难等技术问题。基于上述目的，本技术通过提供木豆提取物及其活性成分的应用来解决该领域中的这种技术问题。

2、一方面，本发明涉及木豆提取物、木豆素a、木豆素c、木豆素、银松素单甲醚或其药学上可接受的盐在制备诺卡氏菌病防治药物中的应用。

3、另一方面，本发明涉及木豆提取物、木豆素a、木豆素c、木豆素、银松素单甲醚或其药学上可接受的盐在防治诺卡氏菌病的饲料添加剂制备中的应用。

4、本发明不对木豆提取物的制备方法做特别限定，一般地，制备木豆提取物的方式包括有机溶剂提取法以及临界萃取法。本发明所指的木豆提取物，其活性成分包括木豆素a、木豆素c、木豆素、银松素单甲醚的至少一种。

5、示例性地，本发明提供了有机溶剂制备木豆提取物及活性单体成分的制备和鉴定方法，其包括：木豆叶经乙醇提取得到木豆乙醇提取物。

6、示例性地，本发明提供了超临界co2萃取法制备木豆提取物的方法，其包括：将干燥木豆叶投入萃取釜中，以co2为萃取剂，对萃取釜、解析釜ⅰ、解析釜ⅱ分别进行加热，当温度分别达到50℃、43℃、37℃时通过高压泵对萃取釜、两个解析釜进行加压，当压力分别达到28mpa、15.5mpa和9mpa时，开始循环萃取并保持恒温恒压，萃取时间为120min，每循环10min，从解析釜ⅰ、解析釜ⅱ放料，得到木豆提取物。

7、本发明不对木豆素a、木豆素c、木豆素、银松素单甲醚的制备方法做特别限定，一般地，木豆素a、木豆素c、木豆素、银松素单甲醚均能从木豆提取物中获取。

8、本发明还提供了一种制备木豆素a、木豆素c、木豆素、银松素单甲醚的方法，其特征在于，是从木豆叶中分离制备得到的。

9、包括以下步骤：

10、将木豆叶用乙醇或乙醇水溶液提取，提取液浓缩得到木豆乙醇提取物，将木豆乙醇提取物混悬在水中，分别用正己烷、乙酸乙酯萃取得到木豆正己烷部、木豆乙酸乙酯部和木豆水部；木豆乙酸乙酯部经正相硅胶柱层析，以正己烷/乙酸乙酯(v/v 100:0→0:1)体系为流动相梯度洗脱，根据tlc结果合并后旋干，共得11个组分f1-11；

11、f4经甲醇/水体积分数70％→100％及甲醇/丙酮v/v 20:1→0:1为流动相于反相硅胶rp-c18柱上梯度洗脱，分离得到f4-1-f4-5，f4-1经过葡聚糖凝胶柱sephadex lh-20，采用chcl3/meoh(1:3)体系洗脱，得f4-1-1-f4-1-5，f4-1-2以70％乙腈-水为流动相的rp-hplc得到木豆素c；

12、组分f6经反相硅胶rp c18分别以甲醇/水体系体积分数70％→100％及甲醇/丙酮体系v/v20:1→0:1梯度洗脱获得8个组分f6-1-f6-8，f6-2以chcl3/meoh v/v 1:3为流动相，经葡聚糖sephadex lh-20凝胶柱层析后得组分f6-2-1-f6-2-9，f6-2-8经以正己烷-乙酸乙酯v/v5:1为流动相的正相硅胶柱和以70％乙腈-水为流动相的rp-hpl纯化后得银松素单甲醚；f6-3通过sephadex lh-20凝胶柱chcl3/meoh v/v 1:3分离得到组分f6-3-1-f6-3-3，f6-3-3经正相硅胶柱反复层析，最后经70％乙腈-水为流动相的rp-hplc得到木豆素a；f6-4经sephadexlh-20凝胶柱层析chcl3/meoh v/v 1:3得到f6-4-1-f6-4-5共5个组分，f6-4-5经正相硅胶得组分f6-4-5-1-f6-4-5-4，其中f6-4-5-1静置后析出浅黄色固体，即木豆素。

13、优选，所述的乙醇水溶液是体积分数95％乙醇。

14、本发明所述的“防治”是指在可能的诺卡氏菌或导致产生诺卡氏菌病发生因素的存在下，使用后防止或减轻诺卡氏菌富集，治愈或减轻诺卡氏菌病。

15、本发明中，术语“药学上可接受的”是指对接受治疗的受试者的一般健康情况没有长期的有害影响。本发明中，术语“药学上可接受的盐”是指保留了木豆素a、木豆素c、木豆素的生物效力，并且在生物学或其它方面上没有不良作用的盐。药学上可接受的盐是指把母体化合物中的碱基基团转换成盐的形式，如碱基基团(如胺基)的无机或有机酸盐类，一般将母体化合物与常规种类的酸在一个溶剂系统中反应进行制备，无机酸一般包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸或磷酸等；由有机酸一般包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸或水杨酸等。

16、本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：

17、(1)木豆提取物及其活性成分，尤其木豆素a作为一种源于中草药的天然化合物，具有环境友好、耐药性低、环境残留少、生物毒性低、天然易降解等优点。木豆提取物及其活性成分用于防治诺卡氏菌病药物的制备或是用于防治诺卡氏菌病饲料添加剂的制备，可以有效缓解化学药物及抗生素带来的药物残留、环境污染和耐药性问题，完全符合目前绿色无公害水产品的要求。

18、(2)本发明测定木豆素a、木豆素c、木豆素、银松素单甲醚等几种生物活性成分对诺卡氏菌的最小杀菌浓度(minimumbactericidalconcentration，mbc)，实验发现木豆乙醇提取物cje的mbc值为128μg/ml。木豆素a的mbc值为2.56μg/ml。木豆超临界提取物cjse和银松素单甲醚、木豆素c、木豆素的mbc值分别为32-64μg/ml、5.12-10.24μg/ml、5.12-10.24和10.24-20.48μg/ml。这表明了木豆提取物及其菧类活性成分均表现出优异的抗菌性能，特别是木豆素a具备开发为抗诺卡氏菌药物的能力。

19、(3)本发明将木豆素a用于诺卡氏菌病防治饲料添加剂的制备，其制备的饲料添加剂，在10mg/kg的添加剂量下，表现出对诺卡氏菌病优异的治疗效果，说明了木豆素a用于诺卡氏菌病防治药物的制备，可以有效的预防自然状态下诺卡氏菌的感染，从而有效防止诺卡氏菌病的发生。