一种灵芝三萜组分及其在清除衰老细胞和抗肿瘤方面的应用的制作方法

本发明属于中药组分及表征与应用领域，具体涉及一种灵芝三萜组分及其在清除衰老细胞和抗肿瘤方面的应用。

背景技术：

1、灵芝(ganoderma lucidum)为多孔菌科真菌赤芝[ganoderma lucidum(leyss.ex.fr.)karst]或紫芝[ganoderma japonicum(fr.)lloyd]的干燥子实体。灵芝又名仙草、瑞草、灵芝草，是一种我国传统的名贵滋补中药材。其保健和药用价值研究，在我国有着悠久的历史，如《神农本草经》中记载灵芝具有滋身健体、保肝益气、固本培元、延年益寿等功效。现代研究表明，灵芝中含有多糖、三萜、生物碱、核苷、呋喃类衍生物、多肽氨基酸、甾醇类、油脂类等化学成分，而灵芝三萜类化合物是灵芝中最主要的活性物质之一，具有抗肿瘤、抗炎等重要生物活性。

2、如中国专利cn108129541a中公开了一种从灵芝中提取的三萜类化合物及其方法和应用，以干燥灵芝子实体为原料，经乙醇提取、浓缩、乙酸乙酯萃取、硅胶柱色谱分离纯化、过滤、c18反相色谱填料高压制备分离等步骤后提取得到一种具有药理活性的新的药用化合物，自命名为ganosinensicacid c，该化合物具有在细胞毒活性方面的用途，为发掘灵芝三萜类化合物在抗肿瘤等方面提供了一定的药用参考价值。

3、靶向衰老细胞(senescent cells)是抗衰老的新策略，可使用的药物分为两类：一类是能够抑制衰老细胞功能如衰老相关的分泌表型(sasp)的药物称之为senomorphics，这类药物可以抑制、拮抗或中和sasp成分,因此需要连续给药才能产生效果；另一类是近年新兴的能够清除衰老细胞的药物称之为senolyitics，通过senolytics的策略,因其可以根本性解决组织器官和肿瘤的病理根源,即衰老细胞,而且能通过间歇性给药产生多重益处(《中国医学前沿杂志(电子版)》2023年第15卷第10期，18-25)。国际最新研究发现，放、化疗等常规的肿瘤治疗均可诱导肿瘤细胞形成衰老细胞，衰老细胞通过sasp向其微环境分泌炎性细胞因子、生长因子等，塑造促进肿瘤复发、转移微环境，并通过激活衰老细胞的抗凋亡途径的激活对放、化疗产生抵抗，衰老细胞是造成肿瘤耐药、复发、转移的根源，因此成为肿瘤的新特征，清除衰老细胞是治疗肿瘤的新策略(cancer discov.2022；12:31-46)。

4、目前，已经从灵芝属的子实体、菌丝体和孢子粉中得到了多种三萜化合物，大量研究表明灵芝三萜类化合物具有显著的抗肿瘤活性。然而从灵芝中得到的单体三萜化合物含量很低且制备工艺复杂，无法满足医药需求。因此需要开发一种提取得率高且稳定、高效液相色谱指纹特征明确、质量可控的灵芝活性三萜组分并对其应用进行研究。

技术实现思路

1、基于现有技术中存在的的不足，本发明通过对灵芝子实体乙醇提取物不同组分的药理活性筛选，得到一个提取的率高、高效液相色谱指纹特征明确、质量可控的活性三萜组分，命名为nt，并发现该组分具有较强的清除衰老肿瘤细胞的新功能以及抗肿瘤活性。

2、本发明以灵芝子实体为原料分离得到灵芝三萜组分(nt)，并对nt的高效液相指纹图谱及其所含灵芝三萜的组成特征进行表征，首次公开nt具有清除衰老细胞和抗肿瘤的作用，是从灵芝提取的一种具有抗肿瘤活性的senolytics，可制备用于防治包括肿瘤在内的衰老相关疾病的药物、保健食品或食品。

3、一方面，本发明提供了一种灵芝三萜组分，所述的灵芝三萜组分中总三萜含量≥30％，所述的灵芝三萜组分包括灵芝酮三醇、灵芝酸x、灵芝酮二醇、灵芝醇b、灵芝醇a、灵芝醛a和麦角甾醇，按重量百分含量计，灵芝酮三醇≥1.8％、灵芝酸x≥0.1、灵芝酮二醇≥0.7％、灵芝醇b≥0.7％、灵芝醇a≥2.5％、灵芝醛a≥0.2％、麦角甾醇≥0％。

4、另一方面，本发明还提供了上述灵芝三萜组分的测定方法，以灵芝酮三醇、灵芝酸x、灵芝酮二醇、灵芝醇b、灵芝醇a、灵芝醛a、麦角甾醇为标准品，采用agilent1290infinityⅱ超高效液相色谱仪进行分析，所用试剂采用色谱纯，其检测方法如下：色谱柱agilent eclipse plus c18，流速1ml/min，柱温35℃，用pda检测器，检测波长254nm，流动相a乙腈和b 0.04％甲酸水，梯度洗脱:0min，a：50％，b:50％，30min，a：65％，b:35％，65min-80min：a：100％，b:0％。nt样品溶于甲醇浓度为5mg/ml，标准品溶于甲醇浓度为30μg/ml，进样量15μl。测得各标准品在uplc谱图上的出峰时间见表1。参照美国药典2020版中usp-nf ganoderma lucidum fruiting body的方法计算各标准品在nt中的含量(％)，综合灵芝活性三萜组分nt的多次检测结果结合其药理活性和量化生产条件，制定上述标准品在nt中含量的基本要求(表1)。在nt的uplc指纹谱图中，出峰时间在1.7-8.1min的峰面积之和应占总谱图(1.7-80min)峰面积之和的比例≤25％。

5、表1灵芝活性三萜组分nt中各标准品的含量与出峰时间

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7、再一方面，本发明提供了上述灵芝三萜组分的制备方法，包括如下步骤：

8、1.原料提取：取1-2cm大小的灵芝颗粒，加入原料重量8-10倍的95％的乙醇，浸泡1h后，回流提取3-4次，每次1-3h，合并提取液，过滤，减压浓缩干燥得到乙醇提取物ge；

9、2.大孔树脂法：取ge加乙醇溶解，再调节乙醇浓度至50-60％，样液浓度至0.2-0.4g生药/ml，静置沉淀，离心过滤，所得澄清液备用。取d101型或ab-8型大孔树脂，按厂家产品要求预处理后装柱，树脂柱的径高比1:10。澄清液上样，上样流速为1-1.5bv/h，最大上样量为1.4-1.8g生药/ml树脂。上样完成后依次用50％-65％乙醇与85-95％乙醇作为洗脱剂，洗脱流速2-3bv/h，各洗脱4-6个柱体积，收集洗脱液；将90-95％乙醇洗脱收集合并，浓缩蒸干得到nt。

10、再一方面，本发明还提供了上述灵芝三萜组分在制备清除衰老细胞或抗肿瘤药物中的应用。

11、所述的清除衰老细胞包括但不限于诱导细胞凋亡清除衰老细胞，并抑制衰老细胞的sasp，阻断衰老细胞促进肿瘤细胞增殖的作用或抑制衰老细胞对正常组织器官的损害。

12、所述的肿瘤包括但不限于肝癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、口腔癌、急性白血病、慢性白血病、淋巴瘤、鼻咽癌、结肠癌。

13、所述的灵芝三萜组分可单独施用或与一种或多种化疗药物联合应用。

14、具体为：对于化疗药阿霉素诱导的衰老细胞模型，本发明所获得的灵芝活性三萜组分nt可通过诱导细胞凋亡清除衰老细胞，并抑制衰老细胞的sasp，阻断衰老细胞促进肿瘤细胞增殖的作用，抑制衰老细胞对正常组织器官的损害。对于小鼠肿瘤模型，nt与化疗药物联合应用，可增强化疗药的抗肿瘤的疗效、降低化疗药物的毒副作用。

15、所述的灵芝三萜组分的有效剂量为5mg/kg-500mg/kg。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

17、本发明以灵芝子实体为原料分离得到灵芝三萜组分(nt)，并对nt的高效液相指纹图谱及其所含灵芝三萜的组成特征进行表征，首次公开nt具有清除衰老细胞和抗肿瘤的作用，是从灵芝提取的一种具有抗肿瘤活性的senolytics，可制备用于防治包括肿瘤在内的衰老相关疾病的药物、保健食品或食品。