RNF126在诊断和治疗男性不育症中的应用

本发明涉及生物医药领域，具体涉及rnf126作为靶标在诊断和治疗男性不育症中的应用。

背景技术：

1、据世界卫生组织预测，在21世纪，不孕不育将成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病。目前世界上不孕夫妇约6000～8000万对，中国不孕夫妇约1200～1500万对，其中单纯男性因素导致的不孕约占不孕病例的30％，而男性因素占不孕总体因素的大约50％。campbell-walsh泌尿外科学指出，男性不孕精液分析中约有86％的患者存在精液常规多参数或单项的异常，包括少精子症、弱精子症，以及无精症等。

2、男性生殖系统中，睾丸组织中精子发生是其根本所在。睾丸小叶主要由间质和实质两部分构成，间质部分主要是生精小管间填充的疏松结缔组织，由leydig细胞、巨噬细胞、淋巴管、血管等组成。其中leydig细胞合成和分泌睾酮进入生精小管，促进精子发生。实质部分的主体为完成精子发生功能的生精小管，主要细胞类型为特化的生精细胞和支持细胞(sertoli cell)。生精细胞包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子五种类型，上述细胞在精曲小管的位置依次由周边到管腔面。精原细胞紧贴管的基膜分为暗型精原细胞(ad)、亮型精原细胞(ap)和b型精原细胞(b)。ad型精原细胞作为干细胞，分裂后产生新的精原细胞，ad型细胞除了作为干细胞保留以外，还产生ap型精原细胞，再分化成b型精原细胞，经有丝分裂形成初级精母细胞，之后再进行两次连续的减数分裂，形成单倍体精子细胞，然后精细胞经过形态变化而形成精子。另一方面，由于每个sertoli细胞都支持一个相对固定数量的生殖细胞，因此，sertoli细胞也是精子产生的关键决定因素之一。

3、哺乳动物的精子发生是一个复杂的而有规律的细胞分化过程，包括精原细胞增殖、精母细胞减数分裂和精子细胞变态成熟三个阶段。细胞周期控制细胞的生长和分裂，是保证精子能够正常发生的基础。细胞周期是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的全部活动过程，分为间期与分裂期，间期分为dna合成前期(g1期)、dna合成期(s期)和dna合成后期(g2期)，分裂期(m期)又分为前期、中期、后期与末期，此外还包括脱离细胞周期暂时停止分裂的g0期。参与细胞增殖周期调控的主要因子有：细胞周期蛋白(cyclin)，周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase,cdk)，周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin kinase inhibitor,cki)。cdk与cyclin-cdk复合物促进细胞周期进程，而cki通过与cyclin，cdk以及cyclin-cdk复合物的结合抑制并阻断细胞周期进程。cki分为两类：(1)ink4(inhibitor of cdk4)，如p16、p15、p18、p19，特异性抑制cdk4·cyclin d1、cdk6·cyclin d1复合物。(2)kip(kinase inhibition protein)：包括p21(cyclin inhibitionprotein 1)、p27(kinase inhibition protein 1)、p57等，能抑制大多数cdk的激酶活性。因此，探讨精子形成过程中细胞周期相关因子的表达调控对解明精子形成的机制至关重要。

4、蛋白质稳定性调控中最重要的调控方式是泛素化修饰。泛素化修饰系统中泛素化酶促进蛋白质底物形成泛素链，随后泛素化的蛋白质底物被蛋白酶体降解；去泛素化酶则去除蛋白质底物上的泛素链，避免蛋白质底物被降解，维持蛋白质自身的稳定性。

5、泛素(ubiquitin,ub)是一种含有76个氨基酸的高度保守的小蛋白，普遍存在并高度表达于从单细胞酵母到人类的所有真核细胞中。泛素-蛋白酶体系统包括泛素，蛋白酶体和一系列相关酶，即泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme,e1)，泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme,e2)，以及泛素连接酶(ubiquitin ligase,e3)，其中e3决定了底物蛋白的特异性。泛素-蛋白酶体是真核细胞蛋白翻译后降解的主要途径，广泛参与细胞的生理病理过程，几乎与人体各系统疾病相关，包括肿瘤、神经系统、免疫系统疾病等。既往研究提示，e3s影响精子发生各个阶段，包括精原细胞增殖、减数分裂过程、组蛋白到鱼精蛋白转化、精子形变等多个过程，以及间质、基质细胞的功能等。

6、我们在先的研究发现rnf126是e3，它广泛表达于核与胞浆中，具有较长的半衰期(>8小时)，可通过ring-finger区域介导自泛素化，但是其具体功能仍然未知。

技术实现思路

1、第一方面，本发明提供了rnf126作为检测靶标在制备诊断男性不育症的试剂盒中的应用；即对rnf126进行检测可以对男性不育症进行诊断。

2、进一步地，rnf126的基因突变为c.202g>a、c.722g>a、c.757g>a和c.782a>c中的至少之一，所述基因突变各自导致以下错义突变：v68m、r241h、d253n、e261a。

3、第二方面，本发明提供了rnf126突变基因作为分子标志物在制备诊断男性不育症的试剂盒的应用，所述rnf126的基因突变为c.202g>a、c.722g>a、c.757g>a和c.782a>c中的至少之一，所述基因突变各自导致以下错义突变：v68m、r241h、d253n、e261a。

4、第三方面，本发明提供了一种诊断男性不育症的试剂盒，其特征在于，

5、所述试剂盒包括用于检测rnf126核苷酸序列和/或rnf126氨基酸序列的试剂。

6、可选地，本发明的试剂盒中，试剂包括pcr检测rnf126基因突变引物，所述基因突变为c.202g>a、c.722g>a、c.757g>a和c.782a>c中的至少一个，优选地，包括检测四个基因突变的引物。

7、可选地，本发明的试剂盒中，试剂包括检测rnf126错义突变的试剂，所述错义突变为：v68m、r241h、d253n、e261a中的至少一个，优选地，包括检测四个错意突变的试剂。

8、本领域技术人员理解，根据现有技术对特定基因的核酸序列和氨基酸序列设计检测试剂是容易实现的。

9、第四方面，本发明提供了一种治疗男性不育症的药物，其包括能够治疗rnf126的基因突变的试剂，所述rnf126的基因突变为c.202g>a、c.722g>a、c.757g>a和c.782a>c中的至少之一。能够治疗rnf126的基因突变的试剂可以包括任意能够修复基因突变的方法所涉及的化学或者生物材料，例如基因编辑，或rnf126蛋白制剂等。

10、可选地，能够治疗rnf126的基因突变的试剂包括rnf126的基因突变的拮抗物质，进一步地，还包括药学上可接受的辅料。

11、第五方面，本发明提供了rnf126基因的检测试剂在制备诊断男性不育症的试剂盒中的应用；

12、具体地，检测试剂可包括用于检测rnf126蛋白、rnf126 dna或rnf126rna序列突变的试剂。

13、第六方面，本发明提供了一种动物模型的制备方法，其特征在于，将动物成骨细胞rnf126特异性敲除，所述动物为小鼠；所述的方法包括如下步骤：

14、建立rnf126基因敲除的打靶载体，打靶载体线性化后，转染es细胞；southernblot筛选两端均正确重组的es细胞单克隆，g显带分析后进行显微注射获取f1代杂合小鼠；

15、f1代杂合子小鼠与cre-deleter小鼠杂交，从而将exon2-8和neo cassette同时敲除，获得的杂合子小鼠相互交产生纯合子小鼠；

16、将rnf126基因的2、3号外显子插入loxp位点的loxp小鼠；

17、将loxp小鼠通过与成骨特异性表达cre的工具鼠osx-cre配繁。

18、本发明至少提供了以下益处：

19、1、首次发现rnf126基因突变在人体中对于生精细胞的影响，即通过实验证明了rnf126基因的功能，以及基因发生突变的位点和突变后产生的后果；

20、2、提供了用于治疗男性不育症的诊断靶标和治疗靶点；

21、3、提供了治疗男性不育症的治疗方法和药剂。