一种以YTHDF3蛋白为靶点的脂质体药物及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药，涉及乳腺癌中ythdf3蛋白的应用，尤其涉及一种以ythdf3蛋白为靶点的脂质体药物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、乳腺癌居全球女性恶性肿瘤发病率及死亡率首位，远处转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。肿瘤侵袭转移的第一步是在细胞水平发生了上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,emt)。emt的过程受n6-腺苷酸甲基化(n6-methyladenosine,m6a)修饰在内的多种表观遗传学的调控。而ythdf3作为m6a修饰识别蛋白在其中发挥重要作用。近年来，研究者通过分析来自不同数据库的乳腺癌rna-seq数据和临床预后资料，都发现高表达的ythdf3提示较短的无复发生存时间(recurrence free survival,rfs)，所谓rfs是指，病人在经过抗肿瘤治疗后，获得完全缓解时到出现复发或者随访截止的时间。rfs越长，表示抗肿瘤治疗的疗效越好。

2、多项研究报道，ythdf3可促进肿瘤的侵袭和转移，中国专利cn116200494a公开了ythdf3在制备诊断和治疗宫颈癌产品中的应用,其具体公开了ythdf3作为生物标记物在制备诊断宫颈癌和宫颈癌淋巴结转移的试剂中的应用；ythdf3蛋白在制备宫颈癌预后评估试剂盒中的应用，该试剂盒以上述蛋白作为预后评估标记物；用于治疗宫颈癌的药物，包括能特异性抑制srebf1基因或蛋白、能特异性抑制ythdf3基因或蛋白、用于抑制lrp6的m6a修饰的转录本翻译、用于抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的药物中的任一种。上述产品用于诊断和治疗宫颈癌，特异性好。此外，ythdf3可促进宫颈癌淋巴结转移，因此以该分子为标记物的产品，可有效治疗具有淋巴结转移的宫颈癌。然而，目前ythdf3在乳腺癌的生物学功能尚不清楚。靶向失调的ythdf3蛋白的药物可能是治疗乳腺癌的很有前途的候选药物，但目前尚未靶向ythdf3的小分子抑制剂或抗体问世。

3、rna干扰(rnai)是一种高效的序列特异性基因沉默技术，基于该技术的基因疗法为抗肿瘤治疗带来曙光，目前已有多种sirna药物被fda批准上市。但是如何安全有效地将sirna递送到患病部位仍然是一个重大挑战。因此，开发低毒性、高递送效率、可靶向肿瘤的递送系统是未来sirna药物研发的关键。

技术实现思路

1、为实现上述目的，本发明以ythdf3作为分子靶点，通过下调ythdf3蛋白在乳腺癌中的表达，抑制乳腺癌的emt，从而抑制乳腺癌的生长及转移。具体提供了一种以ythdf3蛋白为靶点的脂质体药物及其制备方法和应用。

2、具体本采用以下技术方案：

3、一种以ythdf3蛋白为靶点的脂质体药物，所述脂质体药物为lip-icg/siythdf3，所述lip-icg/siythdf3为一种具有近红外二区荧光成像功能的脂质体rna药物。

4、进一步地，所述脂质体rna药物包括聚乙二醇化的阳离子脂质体、近红外荧光染料吲哚菁绿以及ythdf3的小干扰rna；所述脂质体rna药物通过以rna结合蛋白ythdf3为分子靶点，下调乳腺癌中ythdf3的表达。

5、进一步地，所述小干扰rna的正义链核酸序列如seq id no:1所示；反义链核酸序列如seq id no:2所示：

6、seq id no:1：5'-gguggauuucaccaguuaaug-3'；

7、seq id no:2：5,-uuaacuggugaaauccaccaa-3'’。

8、一种以ythdf3蛋白为靶点的脂质体药物的制备方法，包括以下步骤：

9、s1，制备脂质薄膜：将质量比为6:1.5:0.6:0.25的dotap、dope、胆固醇和dspe-peg2000作为溶质溶解于溶剂三氯甲烷中，所述溶质：溶剂＝1.67g：1ml，溶解后溶液转移至圆底烧瓶中，40℃真空缓慢旋蒸使三氯甲烷完全挥发，获得脂质薄膜；

10、s2，制备脂质体：将s1中制备的脂质薄膜中加入icg水溶液中水化脂质薄膜，超声清洗机在功率120w下冰浴超声至脂质体溶液澄清，通过脂质体挤出器脂质体溶液依次通过200nm、100nm的聚碳酸酯膜，得到粒径均一的脂质体；

11、s3，制备lip-icg溶液：将终产物转移至截留分子量为8000-12000kda透析袋中，使用ddh2o作为透析液，4℃透析8h，重复3个循环以除去多余的icg，得到lip-icg溶液；

12、s4，获得脂质体rna复合物lip-icg/siythdf3：将上述lip-icg溶液与ythdf3的sirna溶液按照8:1的质量混合，室温下孵育30min，得到脂质体rna复合物lip-icg/siythdf3。

13、一种以ythdf3蛋白为靶点的脂质体药物在乳腺癌中的应用。

14、进一步地，所述lip-icg/siythdf3用于抑制乳腺癌的生长。

15、进一步地，所述lip-icg/sirnas用于抑制乳腺癌的肺转移。

16、本发明的机理：

17、lip-icg/siythdf3为一种具有近红外二区荧光成像功能的ythdf3抑制剂，该抑制剂包含聚乙二醇化的阳离子脂质体、近红外荧光染料吲哚菁绿以及ythdf3的小干扰rna，聚乙二醇化的脂质体增加了sirna在体内的循环时间，避免被核酸酶所降解，实现sirna的有效保护，同时降低了阳离子脂质体的毒性；同时，该抑制剂还可通过epr效应被动靶向肿瘤组织，进一步增强了sirna对ythdf3基因的抑制作用，从而抑制乳腺肿瘤的增殖及转移；并且，由于在该抑制剂内加入了近红外荧光染料ic，使得该靶向抑制剂能够可视化肿瘤，实现诊疗一体化，为肿瘤的基因治疗提供新的思路和方法。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

19、(1)本发明提供一种rna结合蛋白ythdf3的应用，该蛋白能够作为抗乳腺癌增殖及转移的靶点；

20、(2)本发明开发了一种具有nir-ii荧光成像功能的脂质体rna药物，该药物能够作为ythde3的抑制剂，靶向干扰ythdf3下调其表达，抑制emt从而抑制乳腺癌的增殖及转移；

21、(3)本发明的lip-icg/siythdf3以聚乙二醇化的脂质体为纳米递送载体，通过被动靶向作用将sirna递送至肿瘤部位，减少了sirna在其他脏器的聚集，避免了sirna被体内的核酸酶所降解，实现sirna的有效递送，进一步增强了靶向ythdf3基因的sirna对肿瘤细胞的抑制作用，从而抑制乳腺癌的增殖及转移；

22、(4)相比于可见光及近红外一区，基于共载icg的近红外二区荧光成像有更好的成像对比度及更大的组织穿透深度，能够进一步实现肿瘤的精准可视化；

23、(5)该发明为在肿瘤的基因治疗提供一种潜在的方法，对改善sirna治疗疗效、提高生活质量具有重要意义。